本文轉自：藥品質量研究本文轉載自“藥品質量研究”公眾號，作者：Yvette-葉
樣品、固定相(色譜柱)和流動相作為液相日常分析的三要素，與我們建立科學穩(wěn)健的分析方法息息相關。日常遇到的各種分析問題，除硬件外，無外乎這三者。
從方法開發(fā)角度來說，從頭設計，過程中解決好這三者之間的關系，一般都能設計一套適合的方法；從重復(藥典)方法來說，理解好各個要素的影響，就能解決好過程中無法重現的問題。今天，我們就來談談液相日常應用三要素之一樣品。
1、樣品組成的考慮
由于待測樣品的組成具有唯yi性，所以對于方法開發(fā)，哪怕只是其中一個組分有差異，也可能導致所開發(fā)的方法不一樣。
比如，對于以下結構：
由于結構的相似性，為同系物，結構差異較少，三個組分均為中性化合物，故我們考慮的是常規(guī)色譜方法能否有效分離含這三個結構差異較小的組分的樣品。
而對于類似的上述另外三個組分，甲苯和丙苯由于結構上的差異，分離是沒有問題的。我們更多的應該考慮2-苯丙酸是否能與甲苯有效分離。(實際上兩者是較好分離的)。
對于另外一組類似的三個組分，更多的困難在于苯丙氨酸的有效保留問題，以及苯丙氨酸的拖尾問題。
從上述三個簡單的小栗子可以看出，盡管樣品的組成都類似，但是由于樣品組分組成的差異，對于分析所需要關注的點和所需解決的困難是有差異的。從DoE的角度來說，開發(fā)一個合適的方法，首先需要對樣品中的組分進行剖析，根據各組分性質，開發(fā)合理的分析方法：
極性小的組合：確保各組分能全部洗脫；
極性大的組合：確保各組分能有效保留；
極性差異非常大的組合，綜合考慮，折中取舍，可選擇多套方法以同時滿足要求；
看到組分組成的時候需要考慮很多的可預見性問題：選擇的分離模式，選擇的流動相組成，選擇的固定相。
對于大部分的藥物來說，都是可電離的，電離的程度關系到組分的疏水保留。對于酸堿化合物，電離情況如下所示：
各化合物解離的程度與疏水保留的關系如下曲線所示：
上圖中，紅色方框中為穩(wěn)定保留區(qū)域，pKa附近，微小的pH變化都能導致保留時間較大的差異，對于中性化合物來說，在整個pH范圍區(qū)間內保留均較穩(wěn)定。
2、樣品濃度的選擇
我們知道，對于一個藥品的雜質譜，其各個雜質的限度是有差異的，根據ICH或者藥典標準，各已知雜質均有各自對應的限度。又因為各個雜質在確定的分析方法下響應不一致，故其定量限也是不一樣的。能否對每一個雜質都能準確定量，取決于響應低的雜質是否滿足定量要求。若樣品濃度過低，在有關物質(雜質)檢測中會導致靈敏度不夠，無法滿足定量限低于報告限的要求。
若濃度選擇過高，對于主成分含量的測試，則導致方法學驗證中含量不呈線性；對于有關物質來說，特別是主峰后的一些雜質，會因為主成分拖尾而導致準確度無法滿足要求；另外，一般情況下，會用流動相來進行稀釋，若主成分濃度太高，則會改變供試品的溶液環(huán)境，使其中帶檢測的某一組分出峰與其對照品有差異。
3、樣品稀釋劑的選擇
說到樣品的稀釋劑，這是咱們分析人員常碰到的問題，也是熟悉的問題。但凡做分析的小伙伴，都能對溶劑效應道出個123來。
對于溶劑效應，小伙伴們的第yi反應肯定是在反相色譜分析過程中，由于用純乙腈/純甲醇等高比例有機相溶解樣品，然后在進樣后發(fā)現色譜圖中處于前面的峰發(fā)生裂峰的問題。這是由于供試品中的溶劑強度高于流動相的關系。解決方式除了可以換稀釋劑外，還可以嘗試減少進樣量來進行改善。
另一種溶劑效應是由于樣品的加入，導致供試品的pH和流動相的pH差異較大，導致流動相無法在短時間內讓進樣的供試品達到平衡而導致出峰異常，包括峰形異常和出峰時間與對照品有差異。
稀釋劑的選擇還可能會造成鹽析。特別是對于一些從原料藥方法衍生而來的針對制劑的檢測方法。由于制劑中輔料成分相對更加復雜，某些原料藥使用的稀釋劑可能會讓制劑供試品產生鹽析，導致出峰異?；蛘哂绊懡M分的回收率，影響檢測的重現性，甚至導致色譜柱及儀器堵塞。
后一種情況則是由于溶出等特殊情況，導致供試品溶液中有其他成分，如SDS等，干擾測試，導致出峰異常；或者是由于溶出液pH不一致，導致的出峰異常，這個情況與前述的pH不一致歸因一致。
