非食用著色劑酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引號(hào)：C.I. 15510，是一種常用的工業(yè)染料，有強(qiáng)致癌性。因其色澤鮮艷、勻染性好、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生產(chǎn)加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用著色劑的檢測(cè)范圍。目前，國(guó)家已經(jīng)發(fā)布3個(gè)推薦性的食品中酸性橙Ⅱ檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但由于不同實(shí)驗(yàn)室間儀器、人員、實(shí)驗(yàn)耗材、樣品等條件存在差異，*執(zhí)行方法就能達(dá)到回收率、精密度要求的情況很少。因此，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行方法的優(yōu)化是必要的。
近，小編在用不同的基質(zhì)按照標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ號(hào)的檢測(cè)方法》做酸性橙Ⅱ回收實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)回收率不很理想，而且6.1.2所規(guī)定的固態(tài)樣品前處理方法非常耗時(shí)(特別是凈化前提取液需“濃縮約至10mL”這一步)。因此小編依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)不同實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行了一些優(yōu)化，在這里將全過(guò)程分享給各位朋友以供參考交流~
樣品凈化步驟
樣品凈化步驟優(yōu)化涉及SPE小柱與濾膜的選擇、固相萃取操作步驟。
首先，我們需要按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所用SPE小柱與濾膜是否滿足當(dāng)下實(shí)驗(yàn)條件需求：
1. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)3.6節(jié)(見(jiàn)下圖)選擇對(duì)應(yīng)的SPE小柱。
由此，小編選擇了月旭Welchrom® NH2小柱(500mg/6ml,30pk，貨號(hào)：00509-11006)。
2. 使用酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)6.1.3節(jié)的凈化方法(見(jiàn)下圖)進(jìn)行固相萃取操作(小柱的活化方法見(jiàn)3.6)，留取每一操作步驟的樣液用于上機(jī)檢測(cè)。
在這里，小編移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液，加10mL水混勻作為上樣溶液,并根據(jù)6.1.3分別收集上樣液、淋洗液、洗脫液、二次洗脫液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)(此方法又稱(chēng)“分步留樣”，是分析SPE操作過(guò)程中影響回收率的環(huán)節(jié)及原因的常用方法)。
3. 選擇合適的濾膜過(guò)濾樣液，上機(jī)檢測(cè)。
根據(jù)6.1.3，樣液上機(jī)前要過(guò)膜凈化。我們都知道，濾膜作用是凈化樣液，防止雜質(zhì)污染色譜柱。但使用濾膜(或使用不合適的濾膜)可能會(huì)影響目標(biāo)物的回收率甚至引入雜峰。因此，小編嘗試了三種過(guò)膜方式：1) 不過(guò)膜；2) 水系濾膜；3) Nylon濾膜。
藍(lán)色為樣液不過(guò)膜，峰面積12.0191
粉色為樣液過(guò)水系濾膜，峰面積11.4695
黑色為樣液過(guò)Nylon濾膜，峰面積6.4975
結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)膜后，過(guò)膜樣液的圖譜峰面積：過(guò)Nylon濾膜<過(guò)水系濾膜<不過(guò)膜，說(shuō)明過(guò)水系膜或有機(jī)系膜都對(duì)目標(biāo)物造成一定損失。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣液均不過(guò)膜上機(jī)。建議本實(shí)驗(yàn)樣液上機(jī)前不過(guò)膜。
后，小編發(fā)現(xiàn)上樣液、淋洗液以及兩次的洗脫液中都沒(méi)有目標(biāo)物酸性橙Ⅱ檢出，酸性橙Ⅱ終的回收率已經(jīng)達(dá)到了95%-105%，滿足了檢測(cè)的要求。
樣品提取步驟優(yōu)化
其次，按照標(biāo)準(zhǔn)方法小編進(jìn)行了空白基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證樣品提取步驟是否影響不同基質(zhì)樣品中目標(biāo)物的回收。實(shí)驗(yàn)方法如下圖所示。、
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，小編發(fā)現(xiàn)：
6.1.2固態(tài)試樣提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液(配制方法見(jiàn)3.4)提取2遍，再合并提取液，濃縮至10mL。
此時(shí)洗脫液總量約40mL，需40℃濃縮至10mL左右【相當(dāng)于除去乙醇】。整個(gè)濃縮過(guò)程非常耗時(shí)，差不多處理一個(gè)樣要一小時(shí)，而且終的結(jié)果回收率非常不理想。
按照第yi次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，小編進(jìn)行了一些優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)上是全部提取液濃縮至10mL左右后凈化，改為移取了其中20mL經(jīng)濃縮至約5mL后上樣。
根據(jù)第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，回收率已經(jīng)達(dá)到了90%-100%，滿足了檢測(cè)的要求。
終優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)步驟和譜圖
一、提取
稱(chēng)取樣品2g(±0.01g)于50mL離心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超聲提取30min，離心10min(4000r/min)，吸取上清液于另一50mL離心管中；殘?jiān)屑尤?0mL乙醇-氨溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，混勻，準(zhǔn)確移取20mL上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于5mL,轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，用水定容至10mL，待凈化。
二、凈化
SPE柱：月旭Welchrom® NH2規(guī)格：500 mg/6mL
活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液過(guò)柱，棄去流出液
上樣：將待凈化液全部上樣，自然流干，棄去流出液
淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，棄去流出液
洗脫：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集于15mL試管中，抽干小柱
濃縮：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC檢測(cè)。
三、儀器條件
色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm
流動(dòng)相：乙酸銨：甲醇=35:65
柱溫：35℃
進(jìn)樣量：20μL
檢測(cè)波長(zhǎng)：484nm
流速：1.0mL/min
總結(jié)
在優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)方法的時(shí)候：
1）先選擇合適的SPE小柱，用目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行固相萃取操作，分步排查SPE步驟，確認(rèn)小柱與標(biāo)準(zhǔn)方法是否滿足具體要求；
2）再按標(biāo)準(zhǔn)方法，做空白基質(zhì)加標(biāo)，確認(rèn)前處理樣品提取步驟中目標(biāo)物的損失情況，分析造成目標(biāo)物損失的原因及步驟，有針對(duì)性優(yōu)化方法；
3）接著做樣品和樣加標(biāo)，看目標(biāo)物回收率情況，優(yōu)化提取量或提取次數(shù)；后得出一個(gè)穩(wěn)定的方法，保證滿足標(biāo)準(zhǔn)回收率要求進(jìn)行檢測(cè)。
