小分子越來(lái)越難做，大分子發(fā)展很強(qiáng)勢(shì)，似乎成為了近年來(lái)藥物研發(fā)市場(chǎng)的重要表現(xiàn)之一，“多肽”類(lèi)藥物正是其中的一大熱門(mén)。目前多肽藥物的質(zhì)量監(jiān)管日趨漸嚴(yán)，在這種趨勢(shì)下，尋找能滿(mǎn)足更高分離度，靈敏度的分析方法就顯得尤為重要。很多小伙伴在在開(kāi)發(fā)多肽類(lèi)樣品分析方法中總是遇到各種的問(wèn)題，無(wú)比煩惱。這里小編就總結(jié)了一些在多肽方法開(kāi)發(fā)中常見(jiàn)的問(wèn)題分享給各位小伙伴。
1、多肽含量與多肽純度有什么區(qū)別？
一條多肽產(chǎn)品中除了多肽本身還包括生產(chǎn)過(guò)程中帶入的水份及有機(jī)鹽分等雜質(zhì)，多肽純度僅指多肽本身所含肽產(chǎn)品的含量及雜質(zhì)的含量，不包括水份等雜質(zhì)；而多肽含量則是指目標(biāo)多肽在產(chǎn)品中的凈含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來(lái)檢測(cè)；因此一條多肽即使純度達(dá)到99%，因?yàn)楫a(chǎn)品中還包含水份及有機(jī)鹽分等，它的含量可能也只有70-80%。
2、如何溶解多肽？
多數(shù)多肽都可以用超純水溶解，對(duì)于一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對(duì)于酸性多肽，可先以小量堿性(如0.1%氨水)溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于堿性多肽，可先以小量酸性(如醋酸，三fu乙酸)溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于疏水性多肽，可用有機(jī)溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。
3、為什么流動(dòng)相中要加入三fu乙酸作為離子對(duì)試劑，還有哪些流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑可用于多肽的分離純化？
加入三fu乙酸能調(diào)節(jié)洗脫液的PH，同時(shí)作為離子對(duì)試劑與多肽相互作用，從而增強(qiáng)分離效果，明顯改善峰形。
其它可用于多肽分離純化的流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑包括醋酸體系，磷酸體系，鹽酸體系，七氟丁酸等通過(guò)適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)PH都能取得很好的分離效果。
另外三fu乙酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去，另一方面，三fu乙酸的紫外大吸收峰低于200nm，對(duì)多肽在低波長(zhǎng)處的檢測(cè)干擾很小。
4、檢驗(yàn)多肽的色譜柱出現(xiàn)柱壓升高，柱效下降該如何解決？
日常對(duì)色譜柱沖洗維護(hù)可以遵循色譜柱出廠(chǎng)說(shuō)明書(shū)，但是在分析多肽等蛋白質(zhì)樣品時(shí)還容易出現(xiàn)一種現(xiàn)象：蛋白污染。主要是柱頭端填料出現(xiàn)結(jié)塊，如果出現(xiàn)蛋白污染，建議使用乙腈-水-三fu乙酸 = 50-50-0.1小流速反向沖洗60倍柱體積或者反向沖洗過(guò)夜。
5、多肽樣品在新的硅膠基質(zhì)色譜柱上不出峰或者峰面積異常小，這是為什么？
這是因?yàn)槿嗫浊蛐喂枘z柱上的非特異吸附位點(diǎn)對(duì)多肽產(chǎn)生死吸附從而導(dǎo)致不出峰。
色譜柱中非特異性吸附位點(diǎn)主要來(lái)源于殘留的硅醇基、硅膠中的殘留重金屬、鍵合相脫落后暴露的硅羥基，柱管內(nèi)壁沒(méi)有被鈍化的位點(diǎn)。這些都會(huì)對(duì)多肽樣品有較強(qiáng)的非特異性吸附。
其實(shí)在開(kāi)始使用新色譜柱時(shí)，對(duì)生物樣品這樣的非特異性吸附會(huì)比較嚴(yán)重，可以對(duì)色譜柱進(jìn)行高濃度樣品飽和處理。在正式檢測(cè)前預(yù)先進(jìn)樣，使樣品在柱子上累積，覆蓋住這樣的位點(diǎn)，才會(huì)使我們以后的分析有好的色譜圖。建議隔一分鐘進(jìn)一次樣，連續(xù)進(jìn)十幾針，用過(guò)量樣品覆蓋掉非特異性吸附位點(diǎn)。等峰面積，峰形穩(wěn)定后就可以正式檢測(cè)樣品。
6、TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)PH的作用？TFA的濃度越高基線(xiàn)漂移越厲害，那是不是說(shuō)TFA的濃度在緩沖液PH允許的情況下越低越好？
(1)TFA起到類(lèi)似離子對(duì)的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過(guò)高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長(zhǎng)時(shí)間使用可能影響柱子壽命。
(2)同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話(huà)?？梢钥紤]加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。
7、在多肽檢測(cè)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)基線(xiàn)漂移的原因是什么？怎么解決？
固定三fu乙酸濃度的梯度洗脫有時(shí)會(huì)在210-220nm檢測(cè)處造成吸收基線(xiàn)的漂移，這是許多反相分離中基線(xiàn)漂移的原因。
降低或消除由于三fu乙酸光譜吸收變化引起的基線(xiàn)漂移需要盡量使檢測(cè)波長(zhǎng)靠近215nm，并在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三fu乙酸補(bǔ)償基線(xiàn)漂移。例如溶劑A中的三fu乙酸為0.1%時(shí)，溶劑B中可用0.085%。
8、如何選擇純化過(guò)程中使用的色譜柱填料？
不同序列的多肽理化性質(zhì)及疏水性有很大的區(qū)別，多數(shù)情況分子量小于4000和親水性多肽用C18柱分離效果z佳，分子量大于5000和j端疏水性的多肽以C4柱分離效果z佳，而C8柱介于C18和C4柱之間，其應(yīng)用效果與C18柱更相似；對(duì)一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱。
9、另附有生物樣品分析過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題和解決建議
月旭科技專(zhuān)門(mén)針對(duì)多肽類(lèi)樣品方法開(kāi)發(fā)
推出Welch生物樣品分析方法開(kāi)發(fā)包
Welch 生物樣品分析-色譜柱方法開(kāi)發(fā)包
包含
Ultimate® XB-C18（300Å）、
Ultimate® LP-C18（300Å）、
Ultimate® XB-C4（300Å）、
Ultimate® XB-C8（300Å）、
Ultimate® LP-C8（300Å）；
規(guī)格：4.6×250mm，5μm
（也可以選擇其他規(guī)格）
★ 適合蛋白、多肽或其他大分子的方法開(kāi)發(fā)為了能更好地與鍵合相發(fā)生作用，需使用大孔徑(300Å)填料
★ 不同保留能力的不同選擇性鍵合相，滿(mǎn)足各種分子大小的蛋白質(zhì)、多肽的保留和分離
附應(yīng)用案例譜圖
