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    各種細(xì)菌具有各自*的酶系統(tǒng),因而對底物的分解能力不同,其代謝產(chǎn)物也不同.用生物化學(xué)方法測定這些代謝產(chǎn)物,可用來區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類.利用生物化學(xué)方法來鑒別不同細(xì)菌,稱為細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn)或稱生化反應(yīng).生物化學(xué)試驗(yàn)的方法很多,這里主要介紹碳水化合物的代謝試驗(yàn)

1．糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)
    (1)原理:不同種類細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖(醇、苷)類的酶,因而對各種糖(醇、苷)類的代謝能力也有所不同,即使能分解某種糖(醇、苷)類,其代謝產(chǎn)物可因菌種而異.檢查細(xì)菌對培養(yǎng)基中所含糖(醇、苷)降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力,可用以鑒定細(xì)菌種類.
    (2)方法:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(如酚紅肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH7.4)加入0.5~1.0％(w/v)的特定糖(醇、苷)類.所使用的糖(醇、苷)類有很多種,根據(jù)不同需要可選擇單糖、多糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等,見表6-4-1.將待鑒定的純培養(yǎng)細(xì)菌接種入試驗(yàn)培養(yǎng)基中,置35℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)孵育數(shù)小時(shí)到兩周(視方法及菌種而定)后,觀察結(jié)果.若用微量發(fā)酵管,或要求培養(yǎng)時(shí)間較長時(shí),應(yīng)注意保持其周圍的濕度,以免培養(yǎng)基干燥.
    (3)結(jié)果:能分解糖(醇、苷)產(chǎn)酸的細(xì)菌,培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)(如酚紅變?yōu)辄S色),產(chǎn)氣的細(xì)菌可在小倒管(Durham小管)中產(chǎn)生氣泡,固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙.不分解糖則無變化.
    (4)應(yīng)用:糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn),是鑒定細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗(yàn)中主要的試驗(yàn),不同細(xì)菌可發(fā)酵不同的糖(醇、苷)類,如沙門菌可發(fā)酵葡萄糖,但不能發(fā)酵乳糖,大腸埃希菌則可發(fā)酵葡萄糖和乳糖.即便是兩種細(xì)菌均可發(fā)酵同一種糖類,其發(fā)酵結(jié)果也不盡相同,如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖,但前者僅產(chǎn)酸,而后者則產(chǎn)酸、產(chǎn)氣,故可利用此試驗(yàn)鑒別細(xì)菌.

2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn)
    (1)原理:細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中,必須有分子氧參加的,稱為氧化型;能進(jìn)行無氧降解的為發(fā)酵型;不分解葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型.發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖,而氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖.本試驗(yàn)又稱氧化發(fā)酵(O/F或Hugh－Leifson,HL)試驗(yàn),可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型.
    (2)方法:挑取少許純培養(yǎng)物(不要從選擇性平板中挑取)接種2支HL培養(yǎng)管中,在其中一管加入高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣(作為密封管),另一管不加(作為開放管).置35℃生化培養(yǎng)箱孵育48h以上.
    (3)結(jié)果:兩管培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸(顏色不變)為陰性;兩管都產(chǎn)酸(變黃)為發(fā)酵型;加液體石蠟管不產(chǎn)酸,不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型.
    (4)應(yīng)用:主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別.腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵型,非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型.也可用于鑒別葡萄球菌(發(fā)酵型)與微球菌(氧化型).
3．甲基紅(MR)試驗(yàn)
    (1)原理:某些細(xì)菌在糖代謝過程中,分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸進(jìn)一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等,使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下時(shí),加入甲基紅指示劑呈紅色.如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少,或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)(如醇、醛、酮、氣體和水),培養(yǎng)基pH在 5.4以上,加入甲基紅指示劑呈桔黃色.
    (2)方法:將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中,35℃生化培養(yǎng)箱48h~96h后,于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑,立即觀察結(jié)果.
    (3)結(jié)果判定:呈現(xiàn)紅色者為陽性,桔黃色為陰性,桔紅色為弱陽性.
    (4)應(yīng)用:常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別,如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌,前者為陽性,后者為陰性.腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性,而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性.

4．β－半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG試驗(yàn))
    (1)原理:乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解.有些細(xì)菌只有半乳糖苷酶,因而只能遲緩發(fā)酵乳糖,所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細(xì)菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黃色的鄰硝基酚.用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別.
    (2)方法:將待試菌接種于ONPG肉湯中,35℃水浴鍋或生化培養(yǎng)箱孵育18~24h,觀察結(jié)果.
    (3)結(jié)果:呈現(xiàn)亮黃色為陽性,無色為陰性.
    (4)應(yīng)用:可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定,本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌均可短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)陽性.埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗(yàn)陽性,而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性.

5．VP試驗(yàn)
    (1)原理:測定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力.某些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌,分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸進(jìn)一步脫羧形成乙酰甲基甲醇.在堿性條件下,乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰,進(jìn)而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物.即V-P試驗(yàn)陽性.
    (2)方法:將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中,35℃生化培養(yǎng)箱24~48h,加入50g/Lα－萘酚(95％乙醇溶液)0.6ml,輕輕振搖試管,然后加0.2ml 400g/L KOH,輕輕振搖試管30s至1min,然后靜置觀察結(jié)果.
    (3)結(jié)果:紅色者為陽性,黃色或類似銅色為陰性.
    (4)應(yīng)用:主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別.本試驗(yàn)常與MR試驗(yàn)一起使用,一般情況下,前者為陽性的細(xì)菌,后者常為陰性,反之亦然.但腸桿菌科細(xì)菌不一定都這樣規(guī)律,如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形桿菌的VP試驗(yàn)和MR試驗(yàn)常同為陽性.

6．膽汁七葉苷水解試驗(yàn)
    (1)原理:在10%~40％膽汁存在下,測定細(xì)菌水解七葉苷的能力.七葉苷被細(xì)菌分解生成的七葉素,七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物.
    (2)方法:將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中,35℃生化培養(yǎng)箱18~24h后,觀察結(jié)果.
    (3)結(jié)果:培養(yǎng)基*變黑為陽性,不變黑為陰性.
    (4)應(yīng)用:主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別,以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌(如脆弱擬桿菌等)的初步鑒別.D群鏈球菌本試驗(yàn)為陽性.
7．淀粉水解試驗(yàn)
    (1)原理:產(chǎn)生淀粉酶的細(xì)菌能將淀粉水解為糖類,在培養(yǎng)基上滴加I液時(shí),可在菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū).
    (2)方法:將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中,35℃生化培養(yǎng)箱18~24h,加入革蘭I液數(shù)滴,立即觀察結(jié)果.
    (3)結(jié)果:陽性反應(yīng),菌落周圍有無色透明區(qū),其它地方藍(lán)色;陰性反應(yīng),培養(yǎng)基全部為藍(lán)色.
    (4)應(yīng)用:用于白喉棒狀桿菌生物型的分型,重型淀粉水解試驗(yàn)陽性,輕、中型陰性;芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定.

8．甘油復(fù)紅試驗(yàn)
    (1)原理:甘油可被細(xì)菌分解生成丙酮酸,丙酮酸脫去羧基為乙醛,乙醛與無色的復(fù)紅生成醌式化合物,呈深紫紅色.
    (2)方法:取被檢菌接種于甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基中,于35℃生化培養(yǎng)箱,觀察2~8d.應(yīng)同時(shí)做陰性對照.
    (3)結(jié)果:紫紅色為陽性,與對照管顏色相同為陰性.
    (4)應(yīng)用:主要用于沙門菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別.傷寒沙門菌、甲(丙)型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺(tái)沙門菌本試驗(yàn)為陰性,乙型副傷寒沙門菌結(jié)果不定,其它不常見沙門菌多數(shù)為陽性.

9．葡萄糖酸氧化試驗(yàn)
    (1)原理:某些細(xì)菌可氧化葡萄糖酸鉀,生成α-酮基葡萄糖酸.α-酮基葡萄糖酸是一種還原性物質(zhì),可與班氏試劑起反應(yīng),出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀.
    (2)方法:將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基中(1ml),置35℃生化培養(yǎng)箱48h,加入班氏試劑1ml,于水浴中煮沸10min并迅速冷卻,觀察結(jié)果.
    (3)結(jié)果:出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽性.不變或仍為藍(lán)色為陰性.
    (4)應(yīng)用:主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群.