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一、 實驗?zāi)康?br />1、掌握氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞的原理、方法和技術(shù)；

2、掌握電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備原理及方法；

3、學(xué)習(xí)并掌握感受態(tài)細(xì)胞效價的檢測方法。
二、 實驗原理
在基因克隆技術(shù)中，所謂轉(zhuǎn)化是指質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒被導(dǎo)入受體細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因，并在一定的培養(yǎng)條件下，在選擇性培養(yǎng)基上長出轉(zhuǎn)化子的過程。質(zhì)粒必須通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，才能進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量的克隆基因。細(xì)菌吸收外源DNA的能力強(qiáng)時的狀態(tài)被稱為感受態(tài)細(xì)胞。有些種類的細(xì)菌在其生長的任一階段都處于感受態(tài)，而另一些細(xì)菌只有處于某個生長時期時，才會處于感受態(tài),如大腸桿菌。大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞制備原理是取對數(shù)生長期的細(xì)菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)。對這種現(xiàn)象的一種解釋是CaCl2能使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增強(qiáng)，目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流，在細(xì)胞上形成孔洞，使外源DNA進(jìn)入胞內(nèi)，從而實現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。電激轉(zhuǎn)化的效率往往比化學(xué)法高出1到2個數(shù)量級，達(dá)到1 x 108轉(zhuǎn)化子每1μg DNA，甚至1 x 109轉(zhuǎn)化子每1μg DNA，所以常用于文庫構(gòu)建時的轉(zhuǎn)化或遺傳篩選
化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70℃保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化。
物理制備法：
電轉(zhuǎn)法，除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率能達(dá)到109 ~ 1010轉(zhuǎn)化子/μg閉環(huán)DNA。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。
轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：
轉(zhuǎn)化總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積 轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每μg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(μg) 理論上轉(zhuǎn)化率為每微克地標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)為1*1010
三、實驗材料
實驗儀器：恒溫振蕩儀、恒溫培養(yǎng)箱、低溫常速離心機(jī)、移液槍、錐形瓶、離心管、LB液體培養(yǎng)基、
實驗試劑：0.1M CaCl2溶液、含10%甘油的0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5α、*0、DE3、BL21、液氮、冰水。
三、 實驗步驟
（一）化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備
（1）菌種的活化：取-70℃的冰箱中感受態(tài)細(xì)胞DH5α、*0、DE3、BL21在LB的平板上進(jìn)行劃線分離。
（2）菌種的前培養(yǎng)：從LB平板上挑取相應(yīng)的單菌落,接種于10ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長中后期。

（3）菌種的準(zhǔn)備：將該四種菌懸液以1:100的比例分別接種于四個不含有抗生100mlLB液體培養(yǎng)基錐形瓶中,37℃振蕩培養(yǎng)大約2.5小時至OD=0.4~0.5。

（4）感受態(tài)細(xì)胞的制備：
①把上述的錐形瓶放到冰水快速使其冷卻。把100 mL培養(yǎng)液均勻分成兩份到50 mL離心管中，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10min。
②棄去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，輕輕混勻，在冰水中靜置30min。

③棄去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管輕輕吹吸讓沉淀充分混勻，在冰水中靜置30min。
④從冰水中取出4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10min，棄去上清液并用移液槍輕輕地把多余的液體吸干凈，加入0.5 mL含10%甘油的0.1M CaCl2溶液。用巴氏管輕輕吸起液體打到壁上使沉淀混勻并放置在冰上。
⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在離心管架子上擺放好0.5ml離心管，用剪過的移液槍頭進(jìn)行分裝，每個離心管中分裝40μL懸浮液。
⑥迅速蓋好蓋子放入到液氮中，使之迅速冷凍，然后放到標(biāo)有感受態(tài)細(xì)胞種類、制作者和時間的袋中，-70℃保存。

（二）電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞的制備
第1、2、3步同化學(xué)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞的制備過程的1、2、3三步相同。

（4）制備感受態(tài)細(xì)：
①把上述的錐形瓶放到冰水快速使其冷卻。把100 mL培養(yǎng)液均勻分成兩份到50 mL離心管中，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10min。
②棄去上清液，加入30 mL 三蒸水，用巴氏管吸起液體打到離心管壁上使沉淀充分混勻，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘下離心10min，倒去上清。重復(fù)兩次；
③再加入30 mL含10%甘油水溶液，在4℃、3000轉(zhuǎn)每分鐘下離心10min，重復(fù)一次。
④棄去上清液，加入0.5 mL GYT medium(含有10%Glysiron、0.125%Yeast Extraction、0.25% Trypton)，放置在冰上。
（5）準(zhǔn)備好成有液氮的塑料盒子和把0.5 mL離心管若干放到離心管架子上，將懸浮的感受態(tài)細(xì)胞分裝在離心管中，每管40μl，迅速蓋好蓋子放入到液氮中，使之迅速冷凍，然后放在標(biāo)有感受態(tài)細(xì)胞種類、制作者和時間的袋中， -70℃保存。

（三）效價檢測
1、化學(xué)轉(zhuǎn)化：
（1）取化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，同時把標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PUC19稀釋十倍置于冰上。
（2）在含有40μl感受態(tài)細(xì)胞的0.5ml離心管中加入1µL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒充分混勻。冰上靜置30min。
（3）將離心管置于42℃干式恒溫器上90s，然后迅速放回冰上，使細(xì)胞冷卻2～3min。
（4）向離心管中加入已預(yù)熱的無菌LB培養(yǎng)液400µL，再轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)45～60min。
（5）將離心管內(nèi)容物混勻，分別吸取4.4µL和110µL菌液于含有AMP的LB固體培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻璃棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于室溫下直到液體被吸收，倒置平板，在37℃過夜培養(yǎng)，然后通過菌落數(shù)計算效價。
2、電轉(zhuǎn)化:

（1）取電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，,標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒也置于冰上，同時準(zhǔn)備干凈的電擊杯于冰上預(yù)冷。

（2）在含有40μl感受態(tài)細(xì)胞的0.5ml離心管中加入1µL稀釋十倍的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，充分混勻。然后轉(zhuǎn)移到電擊杯中，把電擊杯放在電擊儀上進(jìn)行電擊（2500V，5ms）。
（3）在電擊杯中加入160µL無菌LB培養(yǎng)液（無抗生素），然后充分混勻，吸取于10ml離心管中，置于37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)45～60min.
（4）分別取2µL和50µL涂板，涂板操作同化學(xué)轉(zhuǎn)化。
（5）平板放到37℃的恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第二天早上讀取兩個平板的菌落數(shù)。
四、實驗結(jié)果
1、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的效價：涂2µL菌液的平板上菌落數(shù)為88個，通過計算知道，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的效價為8.8×108。
2、化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的效價：無菌落生成，同組的也沒有出來結(jié)果。