一、 實(shí)驗(yàn)原理
大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。微生物接種的方法有很多，常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。
平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體，這就是菌落。
稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。
二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />
1、掌握用平板劃線法分離純化大腸桿菌的方法；
2、掌握用稀釋涂布平板法分離純化大腸桿菌的方法。
三、儀器與用具
高壓滅菌鍋，超凈工作臺，接種環(huán)，培養(yǎng)皿，酒精燈，試管，玻璃涂布器，pH試紙，微量可調(diào)移液器，恒溫培養(yǎng)箱，大腸桿菌，微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)試劑盒
四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
稱取微生物培養(yǎng)試劑盒中的固體培養(yǎng)基6.4g加入200mL水中，加熱充分溶解(可按培養(yǎng)的微生物適合生長條件需要調(diào)節(jié)pH)，121℃高壓滅菌20min待用，可倒平板10個(gè)。
稱取2g液體培養(yǎng)基加100mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃高壓滅菌20min，冷卻后在超凈臺接入100μL大腸桿菌菌種，恒溫振蕩器37℃震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，用滅菌離心管每組分裝1mL實(shí)驗(yàn)備用
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1、倒平板操作：
⑴將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手打開封口膜。
⑵右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。
?、怯米笫值哪粗负褪持笇⑴囵B(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。
?、鹊却桨謇鋮s凝固，大約需要5～10min。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。
2、平板劃線操作：
⑴將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅；
?、圃诨鹧媾岳鋮s接種環(huán)，并打開試管帽；
?、菍⒃嚬芸谕ㄟ^火焰；
⑷將已冷卻的接種環(huán)深入菌液中，沾取大腸桿菌液。
?、蓪⒃嚬芸谕ㄟ^火焰，并蓋上試管冒。
?、首笫謱⒚笊w打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速深入平板內(nèi)，劃三到五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。
?、俗茻臃N環(huán)，待其冷卻后，從一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將后一區(qū)的劃線與一區(qū)相連。
3、系列稀釋操作：
?、艑⒎謩e盛有9mL水的5支試管滅菌，并按101～105的順序編號。
⑵用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中。吹吸三次或震蕩，使菌液與水充分混勻。
?、菑?01倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復(fù)第2步的操作。依次類推，直到完成后一只試管的稀釋。
4、涂布平板操作：
?、庞没鹧孀茻坎计鳒缇缓罄鋮s8～10s。
?、迫∩倭烤?100μL)，滴加到培養(yǎng)基表面。
?、怯猛坎计鲗⒕壕鶆虻赝坎荚谂囵B(yǎng)基表面。
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