關(guān)于柱色譜的詳細(xì)介紹
柱色譜法，又稱層析法。是一種以分配平衡為機(jī)理的分配方法。色譜體系包含兩個(gè)相，一個(gè)是固定相，一個(gè)是流動(dòng)相。當(dāng)兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，反復(fù)多次的利用混合物中所含各組分分配平衡性質(zhì)的差異，后達(dá)到彼此分離的目的。色譜法從發(fā)明到現(xiàn)在已有八十多年的歷史。它是純化和分離有機(jī)或無機(jī)物的一種常用方法。其中固定相極性大于流動(dòng)相的色譜為正相色譜，相反的為反相色譜。根據(jù)相似相溶原理：混合物中在固定相中溶解度大的物質(zhì)后出柱，保留時(shí)間長，難被洗脫。
一、柱色譜的概念
柱色譜是在一根玻璃管或金屬管中迸行的色譜技術(shù)，將吸附劑填充到管中而使之成為柱狀，這樣的管狀柱稱為吸附色譜柱。使用吸附色譜柱分離混合物的方法，稱為吸附柱色譜。這種方法可以用來分離大多數(shù)有機(jī)化合物，尤其適合于復(fù)雜的天然產(chǎn)物的分離。分離容量從幾毫克到百毫克級(jí)，所以，適用于分離和精制較大量的樣品。
二、吸附柱色譜
在吸附柱色譜中，吸附劑是固定相，洗脫劑是流動(dòng)相，相當(dāng)于薄層色譜中的展開劑。吸附劑的基本原理與吸附薄層色譜相同，也是基于各組分與吸附劑間存在的吸附強(qiáng)弱差異，通過使之在柱色譜上反復(fù)進(jìn)行吸附、解吸、再吸附、再解吸的過程而完成的。所不同的是，在進(jìn)行柱色譜的過程中，混合樣品一般是加在色譜柱的頂端，流動(dòng)相從色譜柱頂端流經(jīng)色譜柱，并不斷地從柱中流出。由于混合樣中的各組分與吸附劑的吸附作用強(qiáng)弱不同，因此各組分隨流動(dòng)相在柱中的移動(dòng)速度也不同，終導(dǎo)致各組分按順序從色譜柱中流出。如果分步接收流出的洗脫液，便可達(dá)到混合物分離的目的。一般與吸附劑作用較弱的成分先流出，與吸附作用較強(qiáng)的成分后流出。
三、吸附劑與洗脫劑
根據(jù)待分離組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇合適的吸附劑和洗脫劑是分離成敗的關(guān)鍵。
⒈吸附劑的要求
一種合適的吸附劑，一般應(yīng)滿足下列幾個(gè)基本要求:
?、艑?duì)樣品組分和洗脫劑都不會(huì)發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)，在洗脫劑中也不會(huì)溶解。
?、茖?duì)待分離組分能夠進(jìn)行可逆的吸附，同時(shí)具有足夠的吸附力，使組分在固定相與流動(dòng)相之間能快地達(dá)到平衡。
?、穷w粒形狀均勻，大小適當(dāng)，以保證洗脫劑能夠以一定的流速 (一般為1.5 mL·min-1)通過色譜柱。
?、炔牧弦椎?，價(jià)格便宜而且是無色的，以便于觀察。可用于吸附劑的物質(zhì)有氧化鋁、硅膠、聚酰胺、硅酸鎂、滑石粉、氧化鈣 (鎂)、淀粉、纖維素、蔗糖和活性炭等。其中有些對(duì)幾類物質(zhì)分離效果較好，而對(duì)其它大多數(shù)化合物不適用。
⒉幾種常見吸附劑
?、叛趸X： 市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種類型，粒度規(guī)格大多為100~150目。
堿性氧化鋁 (pH 9-10)適用于堿性物質(zhì) (如胺、生物堿)和對(duì)酸敏感的樣品(如縮醛、糖苷等)，也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內(nèi)酯的水解、醇羥基的脫水、乙酰糖的去乙酰化、維生素A和K等的破壞等不良副反應(yīng)。所以，這些化合物不宜用堿性氧化鋁分離。
酸性氧化鋁 (pH 3.5-4.5)適用于酸性物質(zhì)如有機(jī)酸、氨基酸等的分離。
中性氧化鋁 (pH 7-7.5)適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來分離弱的有機(jī)酸和堿等。
?、乒枘z： 硅膠是硅酸的部分脫水后的產(chǎn)物，其成分是SiO2·xH2O，又叫縮水硅酸。柱色譜用硅膠一般不含粘合劑。
?、蔷埘０罚?聚酰胺是聚己內(nèi)酰胺的簡稱，商業(yè)上叫做錦綸、尼龍-6或卡普綸。色譜用聚酰胺是一種白色多孔性非晶形粉末，它是用錦綸絲溶于濃鹽酸中制成的(制法詳見附錄十)。不溶于水和一般有機(jī)溶劑，易溶于濃無機(jī)酸、酚、甲酸及熱的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中。聚酰胺分子表面的酰氨基和末端胺基可以和酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成強(qiáng)度不等的氫鍵，因此可以分離上述化合物，也可以分離含羥基、氨基、亞氨基的化合物及腈和醛等類化合物。
?、裙杷徭V： 中性硅酸鎂的吸附特性介于氧化鋁和硅膠之間，主要用于分離甾體化合物和某些糖類衍生物。為了得到中性硅酸鎂，用前先用稀鹽酸，然后用醋酸洗滌，后用甲醇和蒸餾水*洗滌至中性。
⒊吸附劑的活度及其調(diào)節(jié)
吸附劑的吸附能力常稱為活度或活性。吸附劑的活性取決于它們含水量的多少，活性強(qiáng)的吸附劑含有少的水。吸附劑的活性一般分為五級(jí)，分別用I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V表示。數(shù)字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ和Ⅲ。向吸附劑中添加一定的水，可以降低其活性；反之，如果用加熱處理的方法除去吸附劑中的部分水，則可以增加其活性，后者稱為吸附劑的活化。
⒋吸附劑和洗脫劑的選擇
樣品在色譜柱中的移動(dòng)速度和分離效果取決于吸附劑對(duì)樣品各組分的吸附能力大小和洗脫劑對(duì)各組分的解吸能力大小，因此，吸附劑的選擇和洗脫劑的選擇常常是結(jié)合起來進(jìn)行的。首先，根據(jù)待分離物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，結(jié)合各種吸附劑的特性，初步選擇一種吸附劑。然后根據(jù)吸附劑和待分離物質(zhì)之間的吸附力大小，選擇出認(rèn)為適宜的洗脫劑。后，采用薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，再進(jìn)一步?jīng)Q定是調(diào)節(jié)吸附劑的活性，還是更換吸附劑的種類，或是改變洗脫劑的極性。直到確定出合適的吸附劑和洗脫劑為止。
物質(zhì)與吸附劑之間的吸附能力大小既與吸附劑的活性有關(guān)，又與物質(zhì)的分子極性有關(guān)。分子極性越強(qiáng)，吸附能力越大，分子中所含極性基團(tuán)越多，極性基團(tuán)越大，其吸附能力也就越強(qiáng)。具有下列極性基團(tuán)的化合物，其吸附能力按下列次序遞增：
-Cl，-Br，-I<-C=C-<-OCH3<-CO2R<-CO-<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-COOH
四、操作方法
⒈裝柱
色譜柱的大小規(guī)格由待分離樣品的量和吸附難易程度來決定。一般柱管的直徑為0.5～l0 cm，長度為直徑的10～40倍。填充吸附劑的量約為樣品重量的20～50倍，柱體高度應(yīng)占柱管高度的3/4，柱子過于細(xì)長或過于粗短都不好。裝柱前，柱子應(yīng)干凈、干燥，并垂直固定在鐵架臺(tái)上，將少量洗脫劑注入柱內(nèi)，取一小團(tuán)玻璃毛或脫脂棉用溶劑潤濕后塞入管中，用一長玻璃棒輕輕送到底部，適當(dāng)搗壓，趕出棉團(tuán)中的氣泡，但不能壓得太緊，以免阻礙溶劑暢流 (如管子帶有篩板，則可省略該步操作)。再在上面加入一層約0.5 cm厚的潔凈細(xì)砂，從對(duì)稱方向輕輕叩擊柱管，使砂面平整。
常用的裝柱方法有干裝法和濕裝法兩種。
?、鸥裳b法：在柱內(nèi)裝入2/3溶劑，在管口上放一漏斗，打開活塞，讓溶劑慢慢地滴入錐形瓶中，接著把干吸附劑經(jīng)漏斗以細(xì)流狀傾瀉到管柱內(nèi)，同時(shí)用套在玻璃棒 (或鉛筆等)上的橡皮塞輕輕敲擊管柱，使吸附劑均勻地向下沉降到底部。填充完畢后，用滴管吸取少量溶劑把粘附在管壁上的吸附劑顆粒沖入柱內(nèi)，繼續(xù)敲擊管子直到柱體不再下沉為止。柱面上再加蓋一薄層潔凈細(xì)砂，把柱面上液層高度降至0.1～l cm，再把收集的溶劑反復(fù)循環(huán)通過柱體幾次，便可得到沉降得較緊密的柱體。
?、茲裱b法：基該方法與干裝法類似，所不同的是，裝柱前吸附劑需要預(yù)先用溶劑調(diào)成淤漿狀，在倒入淤漿時(shí)，應(yīng)盡可能連續(xù)均勻地一次完成。如果柱子較大，應(yīng)事先將吸附劑泡在一定量的溶劑中，并充分?jǐn)嚢韬筮^夜 (排除氣泡)，然后再裝。無論是干裝法，還是濕裝法，裝好的色譜柱應(yīng)是充填均勻，松緊適宜一致，沒有氣泡和裂縫，否則會(huì)造成洗脫劑流動(dòng)不規(guī)則而形成“溝流”，引起色譜帶變形，影響分離效果。
⒉加樣
將干燥待分離固體樣品稱重后，溶解于極性盡可能小的溶劑中使之成為濃溶液。將柱內(nèi)液面降到與柱面相齊時(shí)，關(guān)閉柱子。用滴管小心沿色譜柱管壁均勻地加到柱頂上。加完后，用少量溶劑把容器和滴管沖洗凈并全部加到柱內(nèi)，再用溶劑把粘附在管壁上的樣品溶液淋洗下去。慢慢打開活塞，調(diào)整液面和柱面相平為止，關(guān)好活塞。如果樣品是液體，可直接加樣。
⒊洗脫與檢測
將選好的洗脫劑沿柱管內(nèi)壁緩慢地加入柱內(nèi)，直到充滿為止 (任何時(shí)候都不要沖起柱面覆蓋物)。打開活塞，讓洗脫劑慢慢流經(jīng)柱體，洗脫開始。在洗脫過程中，注意隨時(shí)添加洗脫劑，以保持液面的高度恒定，特別應(yīng)注意不可使柱面暴露于空氣中。在進(jìn)行大柱洗脫時(shí)，可在柱頂上架一個(gè)裝有洗脫劑的帶蓋塞的分液漏斗或倒置的長頸燒瓶，讓漏斗頸口浸入柱內(nèi)液面下，這樣便可以自動(dòng)加液。如果采用梯度溶劑分段洗脫，則應(yīng)從極性小的洗脫劑開始，依次增加極性，并記錄每種溶劑的體積和柱子內(nèi)滯留的溶劑體積，直到后一個(gè)成分流出為止。洗脫的速度也是影響柱色譜分離效果的一個(gè)重要因素。大柱一般調(diào)節(jié)在每小時(shí)流出的毫升數(shù)等于柱內(nèi)吸附劑的克數(shù)。中小型柱一般以1～5滴/秒的速度為宜。
洗脫液的收集，有色物質(zhì)，按色帶分段收集，兩色帶之間要另收集，可能兩組分有重疊。對(duì)無色物質(zhì)的接收，一般采用分等份連續(xù)收集，每份流出液的體積毫升數(shù)等于吸附劑的克數(shù)。若洗脫劑的極性較強(qiáng)，或者各成分結(jié)構(gòu)很相似時(shí)，每份收集量就要少一些，具體數(shù)額的確定，要通過薄層色譜檢測，視分離情況而定。至2018年，多數(shù)用分步接受器自動(dòng)控制接收。
洗脫完畢，采用薄層色譜法對(duì)各收集液進(jìn)行鑒定，把含相同組分的收集液合并，除去溶劑，便得到各組分的較純樣品。
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