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　　1.實(shí)驗
 

　　1.1儀器與試劑
 

　　Agilent液相色譜儀1100HPLC;色譜柱EclipseXDBC18(5Lm,4.6mm×280mm);RE5223旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;ENVI218小柱;0.45Lm超濾膜。UV2200型紫外分光光度計,pHS23C型酸度計,GA3、IAA、ABA標(biāo)準(zhǔn)品均為國產(chǎn)標(biāo)樣,石油醚為優(yōu)級純,甲醇、乙腈為色譜純;實(shí)驗用水均為超純水。
 

　　1.2實(shí)驗方法
 

　　取油菜葉片5.0g,3種激素(GA3、IAA、ABA)按王若仲等(2002年)的方法進(jìn)行提取[8]。色譜條件:柱溫為20°C;流速為0.7mLˆmin;流動相比例:甲醇∶乙腈∶水=20∶20∶60;波長由紫外掃描得出GA3、IAA和ABAzui大吸收波長分別為206nm、254nm、270nm。
 

　　2結(jié)果與討論
 

　　2.1色譜條件的選擇
 

　　(1)流動相強(qiáng)度對各組分保留時間的影響:隨流動相中甲醇含量的增加,即流動相強(qiáng)度增加,則GA3、IAA和ABA等組分保留時間皆縮短,測定周期縮短,但是降低了分離效果、影響激素含量的測定。實(shí)驗確定*流動相配比為:甲醇∶乙腈∶水=20∶20∶60。
 

　　(2)不同流速對分離效果的影響:隨著流速的增加,各組分保留時間均縮短,但重疊現(xiàn)象也加劇,而流速太小則會延長測定時間,實(shí)驗確定*流速選擇為:0.7mLˆmin。
 

　　(3)波長的選擇:紫外多波長掃描GA3、IAA、ABA的*波長分別為:206nm,254nm,270nm;故實(shí)驗采用切換波長法檢測。
 

　　2.2實(shí)際測定
 

　　2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定稱取標(biāo)準(zhǔn)GA3、IAA和ABA樣品各0.0010g,混合并用甲醇(色譜純)定容到100mL容量瓶中,稀釋10倍得到1.00mgˆL三種植物激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液。
 

　　由圖1和圖2可以看出,切變波長法消除了溶劑峰和某些雜質(zhì)峰。當(dāng)多組分體系樣品進(jìn)行檢測時,切變波長法檢測比單一波長檢測減少一些干擾,更利于待測組分的分析檢測。
 

　　2.2.2油菜樣品的測定
 

　　取2.2的供試液,過0.45Lm的超濾膜,經(jīng)HPLC檢測(圖3)。
 

　　2.3回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的測定
 

　　本實(shí)驗分別將10.00mgˆL的GA3、10.00mgˆL的IAA和3.00mgˆL的ABA標(biāo)準(zhǔn)溶液按照樣品的提取方法處理,采用HPLC進(jìn)行9次平行測定,其回收率分別為GA3:90.27%;IAA:96.29%;ABA:98.45%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.3%,4.34%,7.95%,符合激素檢測定量分析要求。
 

　　2.4線性關(guān)系
 

　　采用外標(biāo)峰面積法測定,配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液,用峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x,mgˆL)作線性回歸曲線,得到的回歸方程、校準(zhǔn)曲線的線性范圍和zui低檢出限如表1和表2所示。
 

　　由表1可知,實(shí)驗結(jié)果顯示GA3,IAA和ABA的相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.9938,0.9959,0.9986,線性相關(guān)性較好,各種激素的檢出限均較低,達(dá)到理想效果。
 

　　2.5靈敏度的比較
 

　　不同物質(zhì)有不同的*檢測波長,混合樣品采用單一波長檢測會導(dǎo)致至少有一種待測物質(zhì)達(dá)不到zui大吸收,從而降低了該物質(zhì)的檢測靈敏度;而切換波長法在不同的時間采用不同的檢測波長,使每種待測物質(zhì)均達(dá)到zui高檢測靈敏度。實(shí)驗中ABA在206nm波長下吸收沒有達(dá)到zui大,紫外檢測器其zui大吸收為270nm,而采用切換波長法測定使相同濃度ABA的色譜峰面積、峰高均增大數(shù)倍,顯著提高了ABA的檢測靈敏度,相應(yīng)組分的檢出限均明顯的降低了(見表3),更有利于微量物質(zhì)的定量分析。
 

　　2.6切變波長時間的選擇經(jīng)
 

　　紫外掃描得GA3、IAA、ABA的zui大吸收分別為206nm,254nm和270nm,單波長檢測不能使待測的組分的響應(yīng)值達(dá)到zui大,甚至很多要檢測的組分在固定波長下根本檢測不出來,從而影響測定結(jié)果。為了更好的檢測樣品中的植物激素,減少溶劑等物質(zhì)的干擾,本實(shí)驗采用了切換波長法,確定在206nm下檢測GA3,254nm下檢測IAA和270nm下檢測ABA。由于溶劑保留時間zui小,zui先被檢測到,而且溶劑甲醇在206nm下有較大吸收干擾測定,在320nm以上則吸收很小。故首先選擇檢測波長為320nm使溶劑峰zui小化;3.4min,GA3將要出峰時,將檢測器波長切換到206nm;當(dāng)液相色譜運(yùn)行到4.6min時,溶劑甲醇將要出峰,將檢測器波長切換為320nm;待甲醇出峰終止后,6.8min時再將檢測器波長切換到254nm,以檢測IAA;zui后當(dāng)8.5minABA要出峰時,將檢測器波長切換到270nm,共4次切換波長。切變波長法的時間變換應(yīng)該通過各待測組分的保留時間來選擇,每次切換波長都要密切注意各物質(zhì)響應(yīng)的開始和終止時間,所以嚴(yán)格掌握切換時間是切變波長法的關(guān)鍵。
 

　　3結(jié)論
 

　　液相色譜測定中采用切換波長報道甚少,運(yùn)用切換波長法關(guān)鍵是把握好切換時間。切換波長法的優(yōu)點(diǎn)在于可以使各種待測組分分別選擇*檢測波長,在高靈敏度下進(jìn)行檢測,同時可以使不需要的或干擾物質(zhì)出峰較小,甚至不出峰。當(dāng)多組分體系進(jìn)行檢測時,特別是待測物質(zhì)組分復(fù)雜、含量少時,切換波長法可以避免一些組分對待測物質(zhì)測定的干擾,使待測物質(zhì)出峰明顯,而且可以顯著提高檢測靈敏度,降低檢出限,能夠減低多組分體系定量檢測的困難,并為測定油菜體內(nèi)內(nèi)源激素提供了可靠、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。