質(zhì)粒的構(gòu)建：?jiǎn)?dòng)子的選擇
啟動(dòng)子的選擇對(duì)于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對(duì)于轉(zhuǎn)染過(guò)程本身雖然無(wú)甚影響，但是對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。
啟動(dòng)子可分為2大類(lèi)：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是比較精明的，平時(shí)歇著，一旦接到誘導(dǎo)信號(hào)指示就馬上開(kāi)工干活兒。而組成型啟動(dòng)子比較老實(shí)的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種——比如我們很熟悉的CMV啟動(dòng)子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK啟動(dòng)子啊等等。
獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中可以獲得高表達(dá)活性。在BHK-21中，CMV啟動(dòng)子活性比其他啟動(dòng)子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細(xì)胞）中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時(shí)會(huì)提高，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。
一個(gè)強(qiáng)悍的高表達(dá)組成型啟動(dòng)子是我們做表達(dá)所求之不得的，但是對(duì)于轉(zhuǎn)染本身來(lái)說(shuō)卻不一定好——因?yàn)槿魏纬掷m(xù)過(guò)高表達(dá)外源基因都可能帶來(lái)某種程度的細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞生長(zhǎng)——如果外源基因本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了——因?yàn)檫^(guò)量表達(dá)本身可能已經(jīng)害死了那個(gè)轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞，沒(méi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞又死于篩選壓力。這種時(shí)候一個(gè)不那么“能干”的啟動(dòng)子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例，會(huì)不會(huì)是這個(gè)原因呢？過(guò)猶不及就是這個(gè)道理咯。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)于轉(zhuǎn)染來(lái)說(shuō)，特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達(dá)可以受到我們的調(diào)控——轉(zhuǎn)染的時(shí)候不表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)株后再誘導(dǎo)表達(dá)，使得表達(dá)有毒性的基因或者分析表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在接受某種信號(hào)后“打開(kāi)開(kāi)關(guān)”開(kāi)始工作，也有的相反，在缺失某種信號(hào)后打開(kāi)開(kāi)關(guān)。Clontech還有個(gè)誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴的”，就是說(shuō)不單表達(dá)開(kāi)關(guān)可控，表達(dá)量多少也可以通過(guò)誘導(dǎo)劑的量來(lái)調(diào)控。還有一種特殊的啟動(dòng)子很好玩——具有時(shí)序性或者組織特異性（空間特異性），會(huì)受到特定的元件調(diào)控，在一定的時(shí)間或者特定組織細(xì)胞中表達(dá)的，比如那個(gè)轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子——有人說(shuō)這是組成型的，我覺(jué)得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，只不過(guò)誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了，這類(lèi)啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞中會(huì)有不同的表現(xiàn)，需要注意。誘導(dǎo)系統(tǒng)的問(wèn)題主要是本底表達(dá)，表達(dá)量有限，以及誘導(dǎo)劑本身對(duì)細(xì)胞的影響和如何清除，不過(guò)這些都與轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)。
轉(zhuǎn)染DNA的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子如果不被宿主細(xì)胞識(shí)別也會(huì)產(chǎn)生無(wú)法表達(dá)的“悲劇”，這是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需要注意的問(wèn)題。不過(guò)現(xiàn)在利用現(xiàn)成試劑盒或者模擬國(guó)外已經(jīng)成功的實(shí)驗(yàn)的居多，獨(dú)立構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)的極少，因而這種問(wèn)題遇到的幾率也幾乎可以忽略不計(jì)。

目的基因
這個(gè)對(duì)于研究人員來(lái)說(shuō)是目的，因而沒(méi)有選擇的余地。如果你的目的基因正好會(huì)影響選定細(xì)胞株的生長(zhǎng)，甚至有毒，那hao選擇一個(gè)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，不然你可能總是轉(zhuǎn)染不了。但是通常在實(shí)驗(yàn)之前我們不清楚我們研究的基因產(chǎn)物是否對(duì)選定的細(xì)胞有毒，所以正負(fù)對(duì)照很重要。當(dāng)排除其他原因后轉(zhuǎn)染總是失敗，應(yīng)當(dāng)從根本上考慮原因。

質(zhì)粒的大小和質(zhì)量
線性化還是超螺旋會(huì)影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會(huì)困難一些。畢竟，相對(duì)致密、較小的外源異物被細(xì)胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會(huì)高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會(huì)提供一些促進(jìn)DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。
純化質(zhì)粒的質(zhì)量無(wú)疑會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。哺乳動(dòng)物細(xì)胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉(zhuǎn)染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉(zhuǎn)染真是大陣仗啊，光是提質(zhì)粒做超離就令人皺眉。令人頭疼的是內(nèi)毒素了。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上*的成分，主要是脂多糖中的類(lèi)脂A（lipopolysaccharides），在細(xì)菌被裂解時(shí)被釋放出來(lái)，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，在質(zhì)粒提取的過(guò)程中內(nèi)毒素很容易混入質(zhì)粒DNA中共同純化出來(lái)。內(nèi)毒素的存在會(huì)嚴(yán)重地影響轉(zhuǎn)染效率，此外內(nèi)毒素可能會(huì)激活造血細(xì)胞（例如B細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等）的非特異免疫反應(yīng)，造成實(shí)驗(yàn)中的假陽(yáng)性。所以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)盡量采用無(wú)內(nèi)毒素污染的超純質(zhì)粒。幸好技術(shù)的進(jìn)步令復(fù)雜的操作成為過(guò)去，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)選擇使用轉(zhuǎn)染級(jí)別的質(zhì)粒純化試劑盒純化的質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)染。對(duì)于一些“耐受性高、容易操作的”細(xì)胞株，普通的Kit已經(jīng)夠了。對(duì)于一些對(duì)內(nèi)毒素特別敏感的細(xì)胞，就要用“去內(nèi)毒素”的質(zhì)粒純化Kit了。

質(zhì)粒DNA的濃度和量
既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問(wèn)題，初學(xué)者通常都不會(huì)在乎甚至愿意多加點(diǎn)DNA，但是要注意的是，DNA量過(guò)少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過(guò)多同樣會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。有的初學(xué)者習(xí)慣按照說(shuō)明書(shū)123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？DNA:轉(zhuǎn)染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對(duì)于陽(yáng)離子脂質(zhì)體、多胺等帶電荷的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō)，DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物所帶的凈電荷是由轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例決定的，而轉(zhuǎn)染復(fù)合物是否能更好地結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)胞膜上，很大程度取決于這個(gè)凈電荷。所以預(yù)實(shí)驗(yàn)需要按照說(shuō)明書(shū)的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA，比如Effectene只需要常規(guī)五分之一的DNA。所以轉(zhuǎn)染前hao能定量質(zhì)粒。另外由于質(zhì)粒本身的因素（比如目的基因產(chǎn)物是否有毒、啟動(dòng)子強(qiáng)弱等因素），單獨(dú)DNA也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)基礎(chǔ)的影響，所以同時(shí)做幾組不同量的對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化是很有幫助的。另外值得注意的是，當(dāng)細(xì)胞鋪板密度較高時(shí)，需要的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量也會(huì)略微提高。