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ELISA實(shí)驗(yàn)優(yōu)化做到這些,下個(gè)大神就是您!

時(shí)間:2019/5/8閱讀:274
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一、封閉液、洗滌液及保護(hù)液的優(yōu)化
1.封閉液的優(yōu)化:采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行封閉。其封閉液的組成為:10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白(BSA)。
2.洗滌液的配制:采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法配制洗滌液。
3.酶標(biāo)板保護(hù)液的優(yōu)化:酶標(biāo)板經(jīng)過(guò)封閉后在低溫下僅能存放2周左右,為了延長(zhǎng)固相酶標(biāo)板上抗原的穩(wěn)定性,我們?cè)黾恿艘徊奖Wo(hù)酶標(biāo)板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)、*以及二價(jià)金屬離子,作為酶標(biāo)板保護(hù)劑,在封閉完后加入保護(hù)液于4℃冰箱中孵育放置一個(gè)晚上,同時(shí)與未做保護(hù)的酶標(biāo)板進(jìn)行對(duì)照,然后將保護(hù)的及未保護(hù)的酶標(biāo)板置于37烘箱中放置15天,考察保護(hù)液對(duì)酶標(biāo)板的穩(wěn)定性的影響。

二、酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化
抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標(biāo)抗體做系列稀釋:1:100,1:200;1:300;1:400;1:500;1:600;1:1000;經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后,用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析,選擇A值為1.5左右的酶標(biāo)抗體稀釋度為zui適工作濃度。

三、底物液的優(yōu)化
常用的作為酶聯(lián)免疫吸附試劑有OPD和TMB系統(tǒng),由于OPD有致癌的危險(xiǎn)性以及用前需要溶解等諸多缺點(diǎn),因此我們選用TMB作為底物系統(tǒng),采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法:取適量的TMB溶解在DMSO中,然后加入適量的超純水,配制作為底物B液;溶解適量的過(guò)氧化氫尿素于100mM磷酸-檸檬酸緩沖液中,配制作為底物A液,用前將底物A液及底物B液等體積混合。在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上,上海恒遠(yuǎn)適當(dāng)調(diào)整了TMB的用量以及過(guò)氧化氫尿素的用量,并加入了酶促進(jìn)劑,與文獻(xiàn)報(bào)道的底物進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)方案為:將活化的辣根過(guò)氧化物酶分別作1:1000;1:10000;1:100000;1:200000;1:400000;1:800000等系列稀釋,比較兩種不同配方的底物的靈敏度。

四、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化:
抗原抗體反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間的增加,反應(yīng)量也增加,但達(dá)到一定的時(shí)間后,反應(yīng)即達(dá)到平衡,我們?nèi)》磻?yīng)10min,20min,30min,40min,50min,60min,70min,90min等8個(gè)點(diǎn)進(jìn)行比較,以確定zuijia抗原抗體反應(yīng)時(shí)間。

五、底物作用時(shí)間的優(yōu)化
在其它條件相同的情況下,我們?nèi)?min,10min,15min,20min,25min,30min,35min,40min,50min,60min,80min等11個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較,確定zuijia的底物作用時(shí)間。

 

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