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細(xì)胞養(yǎng)不好,這些注意事項(xiàng)請(qǐng)收好

時(shí)間:2019/6/13閱讀:601
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  養(yǎng)細(xì)胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顧小孩一樣仔細(xì)對(duì)待,愛護(hù)她,呵護(hù)她。如果你照顧的時(shí)候能注意這些問題,會(huì)讓你的細(xì)胞養(yǎng)的更好。下面就將養(yǎng)細(xì)胞的注意事項(xiàng)跟大家交流一下。
 
  1
 
  冷凍管應(yīng)如何解凍?
 
  取出冷凍管后,須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),必須注意安全,預(yù)防冷凍管的爆裂。
 
  2
 
  細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),是否應(yīng)馬上去除 DMSO?
 
  除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞外,絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),在解凍之后,應(yīng)直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附的問題。
 
  3
 
  可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基?
 
  不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基,細(xì)胞大都無法立即適應(yīng),造成細(xì)胞無法存活。
 
  4
 
  可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類?
 
  不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。
 
  5
 
  何謂 FBS,F(xiàn)CS,CS,HS?
 
  FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,兩者都是指胎牛血清, FCS 是錯(cuò)誤的使用字眼,請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
 
  6
 
  培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5% 或 10% CO2?或根本沒有影響?
 
  一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時(shí),則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。
 
  7
 
  何時(shí)須更換培養(yǎng)基?培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?
 
  視細(xì)胞生長密度而定,或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間,按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
 
  除于特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
 
  8
 
  附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?
 
  一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 –20 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低,并可減少污染的機(jī)會(huì)。
 
  9
 
  懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?
 
  一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時(shí),可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部分含細(xì)胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,重復(fù)前述步驟即可。
 
  10
 
  欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來,其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?
 
  欲回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為 1 000 rpm,5~10 分鐘,過高的轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。
 
  11
 
  細(xì)胞的接種密度為何?
 
  依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的重要原因之一。
 
  12
 
  細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分為何?
 
  動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意:由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。
 
  13
 
  DMSO 的等級(jí)和無菌過濾的方式為何?
 
  冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí),必須為 Tissue culture grade 的 DMSO (如 Sigma D2650),其本身即為無菌狀況,次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 4 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì),并可減少污染的機(jī)會(huì)。若要過濾 DMSO,則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。
 
  14
 
  冷凍保存細(xì)胞的方法?欲冷凍保存時(shí),細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?
 
  冷凍保存方法一:冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →(-20 ℃ 30 分鐘) → -80 ℃ 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 長期儲(chǔ)存。
 
  冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下, 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲(chǔ)存。–20 ℃ 不可超過 1 小時(shí),以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中,存活率稍微降低一些。
 
  冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。
 
  15
 
  如何避免細(xì)胞污染?發(fā)生微生物污染時(shí)應(yīng)如何處理?
 
  細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的方法。
 
  如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染,加入相應(yīng)抗生素,直接滅菌后丟棄。
 
  16
 
  支原體 (mycoplasma)污染的細(xì)胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?
 
  不能以肉眼觀察出異狀。除極有經(jīng)驗(yàn)的專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,無法以其外觀分辨。
 
  支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長參數(shù),代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。
 
  偵測出細(xì)胞株有支原體污染時(shí),應(yīng)直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細(xì)胞株。
 
  17
 
  為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,顏色會(huì)偏暗紅色,且 pH 值會(huì)越來越偏堿性?
 
  培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 (通常為 phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果, 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),可以通入無菌過濾 CO2,以調(diào)整 pH 值。
 
  18
 
  各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish,flask 是否均相同?
 
  不同廠牌的 dish 或 flask,其所 coating 的 polymer 不同,制造程序亦不同,雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大的影響,唯有少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同, dish 或 flask 有生長差異。
 
  19
 
  購買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因?細(xì)胞冷凍管解凍后,為何會(huì)有細(xì)胞數(shù)目太少的情形?
 
  研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳;血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳;解凍過程錯(cuò)誤;冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心;懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞;培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤;細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。
 
  研究人員在冷凍細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷,以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
 
  20
 
  收到的冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落的原因?
 
  冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),造成冷凍管裂損,建議使用*小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。
 
  21
 
  如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?
 
  培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長??傊?,首xuan MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng),RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始,各種目的無血清培養(yǎng)首xuan AIM V(12005)培養(yǎng)基(SFM)。
 
  22
 
  L-*在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?
 
  L-*在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-*可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-*在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒有終定論。L-*的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
 
  23
 
  GlutaMAX-I 是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?
 
  GlutaMAX-I 二肽是一個(gè) L-*的衍生物,其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用 L-*來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放 L-*供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定,即使在 121 磅滅菌 20 分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解,如果在相同條件下,L-*幾乎*降解。
 
  24
 
  什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?
 
  酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
 
  丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
 
  25
 
  為什么目錄上說 Hank's * (HBS) 在空氣中使用,不需要 CO2 培養(yǎng)箱?HBS 和 Earle's * (EBS) 有什么本質(zhì)的功能差別?
 
  HBS 和 EBS 的主要差別在于*的水平,在 Eagles (2.2 g/L) 中比在 Hanks (0.35 g/L) 中高。*需用高水平的 CO2 平衡,以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中,溶液會(huì)變堿,Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織,需要用 Eagles 液,如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用 Hanks 液就可以了。
 
  26
 
  二價(jià)離子抑制*活性嗎?使用*時(shí)加入 EDTA 的目的是什么?
 
  二價(jià)離子的確抑制*活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制*的活性。建議*處理細(xì)胞前,用 EDTA 清洗細(xì)胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。
 
  27
 
  其他注意事項(xiàng)
 
  當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下,抗生素不被滅活,可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。
 
  一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。
 
  大部分添加物和試劑多可以凍融 3 次,如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會(huì)影響它的性能。
 
  在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體*溶液。*在 4℃ 就可能開始降解,如果在室溫下放置超過 30 分鐘,就會(huì)變得不穩(wěn)定。
 
  為了保持 CO2 培養(yǎng)箱水盤清潔,需定期 (至少每兩周一次) 用無菌蒸餾水或無菌去離子水更換。

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