我們將著重介紹 Strep-tag^® 在哺乳類細胞表達系統(tǒng)的應(yīng)用。

雖然大腸桿菌 E.coli 表達系統(tǒng)經(jīng)濟實惠，但由于缺乏重要的脂類，分子螫合物，以及重要的翻譯后修飾，用它表達真核蛋白，可能會影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達系統(tǒng)能影響目標蛋白在細胞膜的插入位置、及其應(yīng)有的功能^[1]。除此之外，當目標蛋白大于 50kDa 時，使用大腸桿菌系統(tǒng)可能表達出不完整的蛋白^[2]。

 所以，為了研究特定蛋白的功能（如：信號通路）、生產(chǎn)較大型的蛋白，或進行高解析度的結(jié)構(gòu)分析，愈來愈多的實驗組選擇哺乳類表達系統(tǒng)來生產(chǎn)融合蛋白。其原因為哺乳動物細胞生產(chǎn)出的重組蛋白與人類蛋白十分相似，有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯后修飾^[3]。因此，愈來愈多科學家們更加關(guān)注于—如何從哺乳類細胞中的純化目標蛋白。

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親和標簽的選擇

首先，需考慮選擇合適的親和標簽。常用于哺乳動物表達系統(tǒng)的親和標簽有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag^® 等^[4-12]，整理于下表：

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這些親和標簽在使用上各有千秋。

 使用 His-tag 時，常遇到的問題是寄主蛋白與填料的非特異性結(jié)合，在哺乳動物重組蛋白的純化過程中，這樣的情況更為明顯。由于系統(tǒng)中有很多含有*（histidine）的殘基的蛋白，這種蛋白結(jié)構(gòu)與 his-tag 相似，容易與鎳柱結(jié)合，因此導(dǎo)致目標蛋白純度降低^[13]。

 FLAG-tag 系統(tǒng)可在非變性條件下進行純化，能得到高純度、有活性的蛋白，但其缺點為純化介質(zhì)較為不穩(wěn)定，且純化成本高上許多^[5]。

 另一常用的標簽為 GST-tag，一個 26kDa 的蛋白，其特點是表達量高，具高度抗原性，常用來增加目標蛋白的溶解度，但常常會影響目標蛋白的特性，一般推薦純化后將標簽去除^[8]。

 而 Strep-tag^®（包含 Strep-tag^®II或是 Twin-Strep-tag^®），都是短肽標簽，分別為 8 或 28 個胺基酸，一般不干擾蛋白折疊或活性，因此適合用于蛋白功能性研究^[5]。Strep-tag^® 可以特異性的結(jié)合在 Strep-Tactin^® (二代介質(zhì)) 或 Strep-Tactin^®XT (三代介質(zhì)) 的*的結(jié)合位點。洗脫時使用的脫硫*（適用于二代）或*（三代），對同樣的結(jié)合位點有更高的親和力，能將目標蛋白從同樣位置移除，因此得到的目標蛋白純度一般高于 95%^[12]。

 同時，三代 Strep-Tactin^®XT 與 Strep-tag^® 蛋白的親和力大幅提升，直接加入含目標蛋白的哺乳細胞的培養(yǎng)上清，即可純化出所需蛋白（注: 原本使用二代需先以 Avidin 或是 BioLock 將培養(yǎng)基中的*遮蔽，才不會影響純化表現(xiàn)）。

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三代 Strep-Tactin^®XT 親和力顯著

圖 A 比較了 His-tag 與 Strep-tag^® 直接加入哺乳細胞培養(yǎng)上清的純化目標蛋白的表現(xiàn)。

圖 A

圖 A：分別向 Strep-Tactin^®XT High Capacity 1ml 重力柱（左）和 Ni-NTA 1ml 重力柱（右）中，同時加入含 4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或 mCherry-His-tag (His) 螢光蛋白的 ExpiCHO 細胞培養(yǎng)上清（注: 接下來的實驗皆是取哺乳細胞表達某抗體后的上清，另加入高純度目標蛋白進行實驗)。由圖可見，Strep-Tactin^®XT（左）能率的捕捉 mCherry-TST，而右方的 mCherry-His 幾乎無法掛柱。

 此外，我們也測試了其他的蛋白，例如 SEAP (72 kDa) 或抗體 (mAb，其重鏈為 55 kDa)。圖 B 為以 Strep-Tactin^®XT 純化 SEAP-TST、mCherry-TST與 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析結(jié)果，可見對于不同蛋白，Strep-tag^® 系統(tǒng)都能純化出高純度的目標蛋白。(注: 紅色標記處為 mCherry 的降解產(chǎn)物，非雜帶)

圖 B

因 Strep-Tactin^®XT 與 Twin-Strep-tag 蛋白的高親和力，即使目標蛋白的濃度低，使用 Strep-Tactin^®XT 仍可以有效的捕捉上清中的目標蛋白。表 C 整理了幾個實驗的數(shù)據(jù)，顯示當目標蛋白濃度低于 20 μl/ml 時，得率仍能達到幾近 100%。

表 C

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Strep-Tactin^®XT 普適性高

除了上述實驗所用的 CHO 細胞株外（中國倉鼠卵巢細胞），另一常用于生產(chǎn)蛋白的哺乳動物細胞株為 HEK293(人胚胎腎細胞)，使用上較 CHO 簡單。我們測試了 Strep-Tactin^®XT 的純化表現(xiàn) : 表 D1 為以 Expi293 表達 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后，目標蛋白的濃度。圖 D2 為純化表現(xiàn)的 SDS-PAGE 分析。從中可知，與 ExpiCHO 培養(yǎng)基相同，直接將表達好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin^®XT 高載量重力柱中進行純化，一樣能夠快速的得到高純度的目標蛋白。

表 D1

圖 D2

綜上所述，Strep-tag^® 非常適合用在哺乳動物細胞系中表達目標蛋白，其純化過程也與常見的 ExpiCHO 及 Expi293 培養(yǎng)基相容，不須另外處理，讓實驗流程更為便利。加上 Strep-tag^® 系統(tǒng)在純度上的優(yōu)勢，是目前在這個應(yīng)用上的選擇。

IBA 哺乳動物細胞表達 / 純化蛋白相關(guān)產(chǎn)品

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