流式實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中,除了常見的表面抗原染色,還會(huì)進(jìn)行胞內(nèi)因子檢測(cè),比如:常見的細(xì)胞因子:IFN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF;核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子:FOXP3、GATA3、STAT5;胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)蛋白:MAPK家族 (AKT、P38、JNK、ERK) 等。胞內(nèi)染色步驟相對(duì)復(fù)雜,涉及的變異因素多,很容易出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定、較難重復(fù)等問題。
一般情況下,靜息狀態(tài)的T、B細(xì)胞不產(chǎn)生或極低產(chǎn)生細(xì)胞因子,多數(shù)細(xì)胞因子必須在T細(xì)胞激活后才能分泌產(chǎn)生,所以必須采用體外激活來刺激細(xì)胞因子的表達(dá)。流式胞內(nèi)染色中*常用的活化方法就是使用一定濃度的廣泛性刺激劑:PMA (佛波酯) 和lonomycin (離子霉素),刺激細(xì)胞4-6 h (可優(yōu)化)。
PMA和lonomycin刺激細(xì)胞活化的機(jī)制:在細(xì)胞內(nèi),Protein kinase C(PKC) 的激活,可以引起下游眾多蛋白激酶的磷酸化,形成級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致多種蛋白的表達(dá)引起細(xì)胞的活化。PKC可以在DAG (二酯酰甘油) 和Calcium (Ca2+) 的共同作用下被激活,PMA是一種DAG的模擬物,lonomycin 是Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)劑,可將細(xì)胞器內(nèi)的Ca2+ 轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿,所以PMA和lonomycin的共同作用可以激活PKC,從而引起一系列的下游反應(yīng)。
刺激后的細(xì)胞不能直接進(jìn)行流式檢測(cè),細(xì)胞因子會(huì)分泌到胞外影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,還需要加入阻斷劑,將細(xì)胞因子阻斷在胞內(nèi),有助于細(xì)胞因子的聚集使胞內(nèi)染色信號(hào)增強(qiáng),提高檢出率,所以這一步至關(guān)重要。常用的阻斷劑有兩種:1. Monensin (莫能霉素);2. Brefeldin A (BFA,布雷非德菌素a)。
Monensin是一種離子載體(ionophore),可選擇性結(jié)合單價(jià)陽離子如:Li+、Na+、K+、Rb+、Ag+和Tl+,并把這些陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜內(nèi),破壞跨膜離子梯度;BFA是一種真菌代謝物,可以干擾囊泡自粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)。這兩種阻斷劑的區(qū)別:Monensin的阻斷作用在高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外,BFA的阻斷作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體。