染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一種用于研究目的蛋白在染色質(zhì)上定位的技術(shù)。ChIP 的原理是通過甲醛處理細(xì)胞固定 DNA 和蛋白，然后提取染色質(zhì)，使用超聲或酶解將染色質(zhì)剪切成小片段。

之后使用結(jié)合在染色質(zhì)的目的蛋白或組蛋白修飾特異性抗體富集 DNA 片段。富集的 DNA 片段可以通過 PCR，DNA 芯片或測序進(jìn)行分析。雖然原理看起來很簡單，但 ChIP 是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)的技術(shù)，很多因素都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

如何選擇 ChIP 抗體？

抗體的質(zhì)量是 ChIP 成功非常關(guān)鍵的因素，只有能夠識別染色質(zhì)狀態(tài)下的天然蛋白構(gòu)象的高質(zhì)量的抗體才能用于 ChIP 實(shí)驗(yàn)。

想要知道一個抗體是否適合用于 ChIP 實(shí)驗(yàn)其實(shí)很簡單。正規(guī)廠家的說明書都會有一項(xiàng)是說明應(yīng)用范圍的。挑選抗體時優(yōu)先選擇應(yīng)用范圍有「ChIP」并有相關(guān)數(shù)據(jù)的，說明抗體經(jīng)過檢測，可以用于 ChIP。如果找不到這樣的抗體可以優(yōu)先挑選經(jīng)過 IF、IP、ICC 驗(yàn)證的，之后自己進(jìn)行驗(yàn)證或委托外包服務(wù)公司進(jìn)行驗(yàn)證。

除此之外，在做組蛋白修飾 ChIP 時，因?yàn)楦鞣N組蛋白修飾之間差異非常小，這對抗體特異性提出了更高的要求。如果抗體特異性不夠高導(dǎo)致發(fā)生交叉反應(yīng)，很可能產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。針對這一問題，可以使用包括 384 種不同修飾的組蛋白芯片檢測自己生產(chǎn)組蛋白抗體特異性，保證組蛋白抗體的高特異性。

沒有特異性抗體怎么辦？

如果目標(biāo)蛋白沒有商業(yè)化的抗體可選，一種方式是定制抗體，之后進(jìn)行 ChIP 驗(yàn)證。這種方式的優(yōu)點(diǎn)是檢測到的是內(nèi)源性的蛋白，結(jié)果反映的一定是體內(nèi)真實(shí)的蛋白和 DNA 相互作用。但定制抗體成本較高，并且 ChIP 驗(yàn)證過程失敗率高達(dá) 75%。

另一種方式是給目標(biāo)蛋白加標(biāo)簽，通過標(biāo)簽檢測目標(biāo)蛋白。AM-Tag 標(biāo)簽是專門針對 ChIP 設(shè)計(jì)的蛋白標(biāo)簽。通過質(zhì)粒構(gòu)建加到目標(biāo)蛋白 C 端。轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞之后通過特異性 AM-tag 抗體進(jìn)行 ChIP。Active Motif 實(shí)驗(yàn)室通過構(gòu)建雌激素受體（ER）加 AM-tag 標(biāo)簽質(zhì)粒檢測 AM-tag ChIP 效果，結(jié)果數(shù)據(jù)與發(fā)表文章中使用 ER 抗體檢測內(nèi)源性蛋白結(jié)果一致。

沒有足夠的起始樣本怎么辦？

ChIP 是一項(xiàng)富集技術(shù)，不是純化方法。大部分我們感興趣的蛋白或組蛋白修飾分布在整個基因組，只是不同區(qū)域的富集度不同。因此，有意義的結(jié)果需要的富集。

傳統(tǒng)的 ChIP 實(shí)驗(yàn)需要至少兩百萬細(xì)胞作為起始材料，這對于有些珍貴細(xì)胞樣本是非常困難的。解決這個問題的關(guān)鍵是通過 ChIP 的 buffer 及條件優(yōu)化，降低非特異性的背景，實(shí)現(xiàn)*的信噪比。

針對這個問題，一方面通過 buffer 條件優(yōu)化，提供高靈敏 ChIP 試劑盒，zui少可用 1000 個細(xì)胞進(jìn)行 ChIP 實(shí)驗(yàn)。另一方面，也提供低細(xì)胞量的 ChIP-Seq 服務(wù)，對于高豐度目標(biāo)蛋白（如組蛋白修飾）僅需 10000 個細(xì)胞；對于低豐度目標(biāo)蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子），僅需 50000～500000 個細(xì)胞。

如何對 ChIP-seq 進(jìn)行jing確定量？

我們的研究團(tuán)隊(duì)在對不同樣本的 H3K27me3 ChIP-seq 數(shù)據(jù)比較時，發(fā)現(xiàn)了一個有意思的問題。通過 H3K27me3 甲基轉(zhuǎn)移酶 EZH2 的抑制劑處理細(xì)胞以后，免疫印跡檢測結(jié)果表明，H3K27me3 整體水平顯著下降。ChIP-qPCR 也檢測到很多位點(diǎn)的 H3K27me3 水平有明顯下調(diào)。

但用常規(guī)的 ChIP-seq 分析方法比較，并不能檢測到 H3K27me3 水平的下降。造成這個結(jié)果的原因在于在標(biāo)準(zhǔn)的 ChIP-seq 實(shí)驗(yàn)過程中，文庫構(gòu)建需要的 PCR 擴(kuò)增以及常規(guī)數(shù)據(jù)分析時對整體數(shù)據(jù)量的校正掩蓋了樣本間數(shù)據(jù)量的差異。

針對這一問題，Active Motif 憑借多年的 ChIP-seq 服務(wù)經(jīng)驗(yàn)成功研發(fā)出「Spike-In」校正策略。標(biāo)準(zhǔn)的 ChIP 反應(yīng)是使用樣本染色質(zhì)和抗體建立的。在「Spike-in」校正體系中，果蠅（Dropsophila）「Spike-in」染色質(zhì)和識別果蠅染色質(zhì)的抗體也被加入到反應(yīng)體系中。因?yàn)楣壍幕蚪M和人的基因組同源性很低，在做測序分析的時候，它就可以作為內(nèi)參，對整個 ChIP-seq 起到矯正作用。

如何檢測染色質(zhì)上蛋白之間的相互作用？

RIME（Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins）是一項(xiàng) ChIP 和質(zhì)譜分析相結(jié)合的技術(shù)。非常適合用于鑒定轉(zhuǎn)錄輔助因子和染色質(zhì)相關(guān)蛋白的相互作用。傳統(tǒng)的鑒定蛋白相互作用的方法是 IP 之后進(jìn)行質(zhì)譜分析。與 IP 方法不同，RIME 使用的起始材料經(jīng)過交聯(lián)，主要檢測的是染色質(zhì)上蛋白之間的相互作用。

怎么檢測同一基因組位置的兩個蛋白質(zhì)或不同的組蛋白修飾？

當(dāng)進(jìn)行 ChIP 實(shí)驗(yàn)去解碼組蛋白編碼時，證明兩個不同的蛋白質(zhì)或者組蛋白修飾占據(jù)同一個核小體位點(diǎn)是非常有意義的?；蛘?，您也許需要確定一個蛋白質(zhì)和特定的組蛋白修飾是否在同一個調(diào)控元件。

Sequential ChIP（也叫做 Re-ChIP）是一項(xiàng)使用兩個不同抗體進(jìn)行連續(xù) ChIP 反應(yīng)的技術(shù)，一次 ChIP 反應(yīng)之后使用特殊 buffer 洗脫沉淀的染色質(zhì)以避免一個抗體對后續(xù) ChIP 的影響。之后加入第二個不同的抗體進(jìn)行 ChIP。通過兩個不同抗體和兩次 ChIP 反應(yīng)，得到兩個蛋白或不同組蛋白修飾所在的同一基因組 DNA 片段。

ChIP 能做 RNA 和蛋白質(zhì)相互作用嗎？

有證據(jù)顯示 RNA 導(dǎo)向過程在介導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表觀遺傳記憶有重要作用。從染色質(zhì)中純化的核酸含有 2～5% RNA；這些 RNA 是非編碼的序列，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄沉默中有重要作用。

然而，因?yàn)槿旧|(zhì)的復(fù)雜度以及染色質(zhì)中大量 DNA 的存在，用傳統(tǒng)的 ChIP 技術(shù)研究這些 RNA 是很困難的。為了使基因組調(diào)控中 RNA 的功能研究變得可能，我們利用其在 ChIP 的技術(shù)研發(fā)了 RNA-ChIP 的一代試劑盒，主要用于研究染色質(zhì)中 RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。

RNA-蛋白質(zhì)的相互作用用甲醛固定，染色質(zhì)剪切結(jié)合 DNA 酶處理得到了可以用特異性蛋白抗體免疫沉淀的 RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物。隨后進(jìn)行解交聯(lián)，解交聯(lián)之后的 RNA 再用 DNA 酶處理確保沒有 DNA 污染。