在過去的十年間，分子生物學(xué)領(lǐng)域的一部分重要進展來自于單個細胞內(nèi)全基因組和全轉(zhuǎn)錄組測序研究。隨著細胞分離和新一代測序的進步，研究人員不再需要分析來自群體中多個細胞的平均信號，而是可以逐個細胞地研究DNA，RNA，蛋白質(zhì)和染色質(zhì)。

  單細胞基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示出了即使是在同一組織中遺傳相同的細胞之間，基因和蛋白質(zhì)表達依然存在差異。但是來自美國Parker癌癥免疫療法研究所的生物學(xué)家Pier Federico Gherardini指出，目前大多數(shù)此類研究只檢查了每個細胞的單層信息，這可能會產(chǎn)生偏差。“你不能只測量RNA，就由此推測蛋白質(zhì)看起來都一樣。”


現(xiàn)階段，科學(xué)家們已經(jīng)開始以單細胞分辨率組合多層信息。這些“多組學(xué)”技術(shù)可以更仔細地觀察細胞之間的可變性，更清楚地識別特定細胞及其功能。分析基因組DNA揭示了單細胞基因組，甲基化組織或染色質(zhì)，而分析RNA和蛋白質(zhì)則能分別產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。


“多組學(xué)比單一層的組學(xué)分析更強大，”英國Sanger研究所的分子生物學(xué)家Lia Chappell說，“這樣才能開始解開所有異質(zhì)性的真正含義，能夠深入挖掘生物機制。”


維也納CeMM分子醫(yī)學(xué)研究中心的基因組研究員Christoph Bock認為，單細胞多組學(xué)特別適用于檢查發(fā)生快速變化的細胞，如活化的免疫細胞，或非常異質(zhì)組織中的細胞，包括腫瘤。


這種方法還可以識別在大量群體中被掩蓋的罕見但具有生物學(xué)重要性的細胞。 Chappell說：“一個典型的例子是那些抗藥性低的細胞，在群體研究中我們無法找到它們，因為他們被上千倍更多的細胞淹沒了。”


然而，單細胞多組學(xué)研究并不容易。目前對于任何單細胞多組學(xué)技術(shù)，還沒有可用的商業(yè)試劑盒，并且許多技術(shù)還存在限制。研究人員必須修改現(xiàn)有的單細胞方案，使其與多種類型的分子兼容，并且要非常小心地將樣品的損失或污染降至zui低。


基因組和轉(zhuǎn)錄組

同時對來自相同細胞的DNA和RNA進行測序可以揭示單個細胞之間的基因組變異，解釋其轉(zhuǎn)錄水平的變化。這樣做還可以更準確地檢測DNA突變。


DR-seq（DNA-mRNA sequencing）這種測序方法發(fā)表于Nature Biotechnology[1]，通過裂解單細胞，并同時擴增裂解物中的DNA和RNA。然后將裂解物分成兩半，一個用于RNA測序（RNA-seq），另一個用于基因組測序。這樣在擴增過程中將DNA和RNA保持在一起，可以zui大限度地減少核酸的損失，但可能會導(dǎo)致潛在的交叉污染。


G＆T-seq（genome and transcriptome sequencing）則是另外一種重要方法[2]，早在2015年生物通就報道過這種技術(shù)（Nature Methods發(fā)布重磅測序技術(shù)：基因組和轉(zhuǎn)錄組平行測序），研究人員當時用G&T-seq對220個小鼠和人類細胞進行測序，獲得了詳細的信息。


具體來說，這種技術(shù)就是利用涂有結(jié)合mRNA的短寡核苷酸序列的磁珠，物理性地從*裂解的細胞中分離mRNA和DNA。然后將DNA和mRNA分別擴增和測序。這樣讓保持mRNA和DNA分離，允許研究人員使用他們選擇的方案分析每種分子，但這可能導(dǎo)致核酸的損失。 目前G＆T-seq已實現(xiàn)自動化，通量相對較高。


表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組

分析細胞表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)可以揭示甲基化和染色質(zhì)可接近性（chromatin accessibility，生物通注）對基因表達的調(diào)控作用。


“在腫瘤發(fā)生等復(fù)雜的生物過程中，異質(zhì)性同時存在于基因組，表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組中，單獨分析它們可能不起作用，”北京大學(xué)分子生物學(xué)家湯富酬教授說。基因相同的腫瘤細胞可能具有不同的DNA甲基化或基因表達模式，可能需要多組學(xué)技術(shù)才能明確地將它們分類為亞群。


scM＆T-seq（simultaneous single-cell methylome and transcriptome sequencing）能同時完成單細胞甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測序分析[3]，這種方法基于G＆T-seq，采用相同的方法從單個細胞中分離DNA和RNA，并擴增和測序RNA。對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為*，然后擴增并測序以測定甲基化組。


研發(fā)技術(shù)人員表示，“這一新的實驗方案讓你可以并行分析同一單細胞中的DNA甲基化和RNA。我們的方法提供了有關(guān)單細胞DNA甲基化異質(zhì)性與特定基因表達差異之間關(guān)系的shou個直觀視圖。”（Nature Methods：突破性單細胞表觀基因組與轉(zhuǎn)錄組分析新技術(shù)）


scNMT-seq（single-cell nucleosome, methylation, and transcription sequencing）則是在scM和T-seq基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[4]，不過這種技術(shù)需要將單細胞分離出來，進行處理，檢測全基因組染色質(zhì)可接近性。不同基因組位置的可接近性，或者保護性會影響基因表達，使用scNMT-seq可以發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞中表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組之間的新關(guān)聯(lián)。


scMT-seq（another method of simultaneously sequencing single cells’ methylomes and transcriptomes）是同時測序單細胞的甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的另一種方法[5]，這種是加州大學(xué)范國平教授和同濟大學(xué)薛志剛教授研發(fā)的，他們利用這種方法對感覺神經(jīng)元進行研究，揭示了細胞間的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組異質(zhì)性。不過，這些差異大多不是啟動子甲基化造成的。舉例來說，啟動子帶CpG島的基因，表達水平與基因體甲基化正相關(guān)。這項研究表明，scMT-seq可以用來檢測單細胞中的轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和單核苷酸多態(tài)性信息，進而解析表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機制。（同濟大學(xué)發(fā)布單細胞測序新技術(shù)）

scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing是一種單細胞三重組學(xué)測序方法[6]，由北京大學(xué)湯富酬教授等人研發(fā)，這種全新的單細胞三重組學(xué)測序方法在上從同一個單細胞中實現(xiàn)對三種組學(xué)高通量測序信息的同時獲取，并從單細胞水平發(fā)現(xiàn)肝癌細胞在三種組學(xué)上存在密切相互關(guān)聯(lián)的高度異質(zhì)性。


scTrio-seq選擇性裂解細胞膜，將細胞質(zhì)中的mRNA與完整細胞核中的基因組DNA分開。對于scMT-seq，實驗人員是利用微量移液管收集細胞核，而在scTrio-seq中，則是通過離心分離細胞核。兩種情況中，基因組DNA都是進行的改良亞硫酸鹽處理和測序方法來檢測甲基化組，而來自細胞裂解物的mRNA則是平行擴增和測序。


“基本上在基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間沒有交叉污染，”湯教授表示。scTrio-seq使用甲基化組序列數(shù)據(jù)計算評估基因組拷貝數(shù)變異，這種技術(shù)已用于分析人結(jié)直腸癌樣本中的異質(zhì)性。


蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組

還有幾種技術(shù)可以同時測定來自單個細胞的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)。這些方法為科學(xué)家提供了轉(zhuǎn)錄后的研究，分析導(dǎo)致蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平之間的差異。


PLAYR（proximity ligation assay for RNA）技術(shù)中，蛋白質(zhì)被不同金屬同位素的抗體標記。同時，RNA轉(zhuǎn)錄物被同位素標記的探針結(jié)合。利用一種稱為質(zhì)譜流式細胞技術(shù)（mass cytometry）的方法測量同位素，并且這種技術(shù)也可以同時檢測每秒數(shù)千個單細胞中的40多種不同的mRNA和蛋白質(zhì)。


CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing）采用寡核苷酸標記的抗體靶向細胞表面蛋白。這種技術(shù)分離并裂解單個細胞，并將它們的mRNA和寡標記抗體與涂有短寡核苷酸序列的磁珠結(jié)合。擴增RNA和抗體標簽并按大小分離，通過測序定量分析蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物。CITE-seq還可同時檢測約100種蛋白質(zhì)以及數(shù)萬種RNA轉(zhuǎn)錄物。


Marlon Stoeckius是紐約基因組中心的分子生物學(xué)家，他是這項技術(shù)的研發(fā)者。目前Stoeckius正致力于將該方法擴展到細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，不過這需要固定和透化細胞，這可能會降低RNA質(zhì)量或?qū)е缕鋸募毎袧B出。


REAP-seq（RNA expression and protein sequencing assay）類似于CITE-seq，采用寡核苷酸交聯(lián)抗體來檢測細胞蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物水平（基于測序）。


REAP-seq和CITE-seq都可以檢測很多的轉(zhuǎn)錄本，但與PLAYR相比，每次檢測的細胞數(shù)量更少。


“我認為它們是互補的方法，”PLAYR的開發(fā)人員Gherardini說，“如果你有一個大的隊列或臨床研究，像PLAYR這樣的東西會更加經(jīng)濟有效”。


CITE-seq還有一個優(yōu)點就是蛋白質(zhì)定量可以在通常單細胞RNA測序制備中丟棄的部分進行，因此“對RNA測序文庫的質(zhì)量沒有任何損害，”紐約基因組中心的Peter Smibert說，“我們認為如果采用RNA-seq作為讀數(shù)，那么就可以使用CITE-seq。”



如何做出選擇

有了這么多種的檢測方法可供選擇，研究人員還需要根據(jù)他們提出的生物學(xué)問題，特定技術(shù)的成本，勞動密集程度和技術(shù)要求來決定使用哪些檢測方法。


“通常這需要技術(shù)專家團隊，計算人員和了解實驗系統(tǒng)的生物學(xué)家合作才能很好地完成這些類型項目的研究，”Bock說。


如何制定技術(shù)方案，選擇方法取決于很多因素，各種技術(shù)的實驗指南存在的一大差異是如何從組織中分離單個細胞，口腔移液和連續(xù)稀釋是相對快速，簡便和低成本的方法，可以zui大限度地降低RNA或蛋白質(zhì)降解的風(fēng)險，但它們通量也相對較低。FACS，機器人操作和微流體是高通量的，但它們很昂貴并且可能在細胞分離上沒有那么精細。


成本是另一個因素。基于指南和試劑的體積（例如酶和抗體），上述這些技術(shù)的價格每個樣品從幾美元到幾百美元不等（這不包括測序的成本，當然測序也可能是限制性的問題）。 “沒有多少科學(xué)家能夠從單個細胞中測序十萬個單基因組，”Chappell說。


對于一批樣品，單細胞多組學(xué)測定可以需要花費超過24小時到近一周的時間，其中涉及手動將細胞核與細胞質(zhì)分離的方法往往較慢，且勞動強度較大，而基于FACS的方法更方便，通量更高。


生物信息學(xué)專業(yè)知識是一個優(yōu)勢。 Stoeckius說：“對于所有的這些分析，你需要一點計算機背景和一些R經(jīng)驗，”這是一種用于統(tǒng)計計算和數(shù)據(jù)分析的編程語言和軟件環(huán)境。


不過這種情況也可能很快就會改變，因為越來越多的人開始使用這種分析，一些公司開發(fā)了易于使用的軟件來分析單細胞多組學(xué)數(shù)據(jù)。目前，諸如SEURAT和MOFA之類的計算軟件包可以集成來自兩個或多個組學(xué)層的數(shù)據(jù)。


隨著單細胞單組學(xué)技術(shù)變得更加靈敏，準確和高通量，相應(yīng)的多組學(xué)技術(shù)也可能得到改善。研究人員還致力于將單細胞技術(shù)與其它數(shù)據(jù)層相結(jié)合，例如空間信息（如CODEX）和功能分析。將細胞的空間信息鏈接到其他組學(xué)層可以幫助研究人員在組織內(nèi)映射不同的細胞類型和功能。


zui終的目標還是從單個細胞中捕獲所有分子的信息——一種“”的信息，但這仍然需要幾年時間。目前，單細胞多組學(xué)正在改變科學(xué)家處理分子生物學(xué)的方式。