當前位置:上海古朵生物科技有限公司>>公司動態(tài)>>遠慕淺談:土壤基因組DNA提取
土壤樣品含有大量的微生物,其中絕大部分的微生物都是無法直接培養(yǎng)進行繁殖和研究。從土壤樣品中提取 DNA 是研究土壤微生物為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物 DNA 的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中,經(jīng)過有效的破壁方法使微生物的DNA 全部釋放到裂解液中,然后再進行分離提取,如 Zhou 的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中,如 Buffer PBS 等,把微生物從土壤中分離出來,然后再進行 DNA 的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金屬鹽對 DNA 提取帶來的影響,但是這種方法會丟失許多微生物,得到的 DNA 并非土壤樣品中的全基因組 ( 宏基因組 ) ,目前已經(jīng)很少研究者會采用這種方法。從土壤樣品中直接提取 DNA 可大可能性地獲得全基因組,但是這種方法卻面臨以下幾個問題:
1. 腐殖酸的污染。土壤中,特別是森林,草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機物分子,部分分腐殖酸同核酸分子非常類似,在純化過程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會導(dǎo)致下游應(yīng)用,如 PCR ,酶切的失敗。
2. 裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物,如細菌和真菌等。革蘭氏陽性細菌和真菌都含有非常厚的細菌壁,讓這些微生物的細胞壁有效破裂是提取高產(chǎn)量宏基因組 DNA 的關(guān)鍵。由于土壤樣品的復(fù)雜性,使用酶法 ( 如*,破壁酶,蝸牛酶 ) 或液氮研磨都不可行,因為土壤中含有各種金屬離子或抑制因子導(dǎo)致消化酶的活性失活,或土壤中的沙粒等會導(dǎo)致液氮研磨很難進行。
3. DNA 得率難于控制。土壤樣品或因肥沃,或因貧瘠,或因含水量豐富,或因干枯,或因取樣的深淺度,都會造成微生物數(shù)量和品種發(fā)生劇烈改變。在一個小范圍的土壤樣品 DNA 含量往往會差別成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化學(xué)成分,如重金屬鹽,粘土物質(zhì)都會造成DNA 得率降低。
Omega Biotek 公司的 E.Z.N.A. Soil DNA Kit 是目前土壤 DNA 提取為優(yōu)化的試劑盒。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學(xué)破壁法,可不需特殊的珠磨儀,在點動渦旋儀就可進行,適合于廣大的研究室。試劑盒中 HTR Reagent 是 Omega Biotek 公司開發(fā)的腐殖酸吸附劑,能去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無醇的硅膠柱純化方式,可去除土壤中各種可溶性金屬鹽,以及其它可溶性的抑制因子。該試劑盒已經(jīng)成功地提取如下土壤 ( 部分是客戶反饋 ) :自然保護區(qū)森林的土壤 ( 長達 30-40 年森林土壤,表層有 30 -50cm 落葉層 ) ,紅樹林土壤,草地,耕地,海底泥,污泥,礦石區(qū)泥土,有機物污染的泥土,池塘泥,垃圾泥,空調(diào)管道堆積物等。
實驗方法
為表明該試劑盒的優(yōu)勢性,我們選擇以下不同組織樣品進行 DNA 提取實驗,每個樣品重復(fù) 3 次。
l 森林類樣品:自然保護區(qū)森林土壤 ( 廣東黑石頂自然保護區(qū) ) 和海南島紅樹林保護區(qū)
l 礦石區(qū)樣品:礦石區(qū)水底土壤 ( 濕 ) 和礦石區(qū)地表土壤 ( 干 )
l 耕地樣品:稻田土壤,菜地土壤
l 有機物污染地表樣品:污水溝衍泥和生活垃圾堆放區(qū)
操作方法(按 Soil DNA Kit 試劑盒進行)簡單描述以下:
1. 取▲ 0.5 g 森林土壤 / 耕地土壤 ,或 ◆ 4g 礦石區(qū)土壤和有機物污染土壤至 15ml 離心管中;
2. 加入▲ 0.5g 酸洗玻璃珠,或 ◆ 4g 酸洗玻璃珠;
3. 加入▲ 1ml Buffer SXL MLus ,或 ◆ 8 ml Buffer SXL MLus ;
4. 立即在渦旋儀上gao速渦旋 3 分鐘。
5. 加入▲ 100ul ,或◆ 800ul Buf fer DS ,渦旋 15s 混勻
6. 轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至 70 oC 水浴鍋中,水浴 10-15 分鐘。
7. 3000 x g 離心 3 分鐘,轉(zhuǎn)移▲ 800ul ,或◆ 7 ml 上清,并加入▲ 270ul Buffer SP2 或◆ 2.3 ml Buffer SP2 ,渦旋混勻;
8. ▲ 10,000 x g 離心 5 分鐘,或 ◆ 5 , 000 x g 離心 10 分鐘;
9. 把上清液轉(zhuǎn)稱至新的 2ml/15ml 離心管中,加入 0.7 倍的異丙醇。 ( 在處理礦石區(qū)樣品時和有機物污染的樣品中,還加入 133ul 糖原溶液 ),渦旋混勻;
10. ▲ 10,000 x g 離心 5 分鐘,或 ◆ 5 , 000 x g 離心 10 分鐘沉淀收集 DNA 。
11. 倒棄上清液,并反扣于吸水紙上 5 分鐘;
12. 加入 200 ul Elution Buffer ,渦旋 5 秒。 6 5 ℃ 水浴 20-60 分鐘,讓 DNA 充分溶液。
13. 加入 50ul HTR, 反應(yīng) 2min 后,離心,取上清。
14. 上清加入等體積(約 200ul ) XP2 Buffer ,均勻后上柱。
15. 加入 300ul XP2 Buffer ,洗滌一次。
16. 加入 700ul SPW Wash Buffer ,洗滌兩次。
17. 空甩后,加入適當量的 Elution Buffer 洗脫即可。
實驗結(jié)果
1. DNA 電泳結(jié)果
取 10 ul 純化的基因組 DNA 上樣于 0.8% 瓊脂糖凝膠, 80V 電泳 30 分鐘,結(jié)果如下。
0.5g 森林類土壤樣品
( 前兩個自然保護區(qū)森林土壤,后兩個為紅樹林土壤 )
0.5g 耕地類土壤樣品
A: 水稻田土壤
B: 玉米土壤
4g 有機物污染土壤樣品
A: 生活垃圾堆放地
B: 污水溝底泥
4g 礦石泥
1 和 3 是兩個礦石區(qū)水底土壤 ( 濕 )
2 和 4 礦石區(qū)地表土壤 ( 干 )
2. DNA 純度和產(chǎn)量分析
土壤類型 | A260 | A280 | A230 | A320 | A260/A280 | 產(chǎn)量 ug |
6 | 0.1792 | 0.1041< |
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