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上海古朵生物科技有限公司
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遠慕淺談:土壤基因組DNA提取

時間:2018-10-22閱讀:318
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   土壤樣品含有大量的微生物,其中絕大部分的微生物都是無法直接培養(yǎng)進行繁殖和研究。從土壤樣品中提取 DNA 是研究土壤微生物為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物 DNA 的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中,經(jīng)過有效的破壁方法使微生物的DNA 全部釋放到裂解液中,然后再進行分離提取,如 Zhou 的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中,如 Buffer PBS 等,把微生物從土壤中分離出來,然后再進行 DNA 的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金屬鹽對 DNA 提取帶來的影響,但是這種方法會丟失許多微生物,得到的 DNA 并非土壤樣品中的全基因組 ( 宏基因組 ) ,目前已經(jīng)很少研究者會采用這種方法。從土壤樣品中直接提取 DNA 可大可能性地獲得全基因組,但是這種方法卻面臨以下幾個問題:  

1.          腐殖酸的污染。土壤中,特別是森林,草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機物分子,部分分腐殖酸同核酸分子非常類似,在純化過程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會導(dǎo)致下游應(yīng)用,如 PCR ,酶切的失敗。  

2.          裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物,如細菌和真菌等。革蘭氏陽性細菌和真菌都含有非常厚的細菌壁,讓這些微生物的細胞壁有效破裂是提取高產(chǎn)量宏基因組 DNA 的關(guān)鍵。由于土壤樣品的復(fù)雜性,使用酶法 ( 如*,破壁酶,蝸牛酶 ) 或液氮研磨都不可行,因為土壤中含有各種金屬離子或抑制因子導(dǎo)致消化酶的活性失活,或土壤中的沙粒等會導(dǎo)致液氮研磨很難進行。  

3.          DNA 得率難于控制。土壤樣品或因肥沃,或因貧瘠,或因含水量豐富,或因干枯,或因取樣的深淺度,都會造成微生物數(shù)量和品種發(fā)生劇烈改變。在一個小范圍的土壤樣品 DNA 含量往往會差別成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化學(xué)成分,如重金屬鹽,粘土物質(zhì)都會造成DNA 得率降低。  

Omega Biotek 公司的 E.Z.N.A. Soil DNA Kit 是目前土壤 DNA 提取為優(yōu)化的試劑盒。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學(xué)破壁法,可不需特殊的珠磨儀,在點動渦旋儀就可進行,適合于廣大的研究室。試劑盒中 HTR Reagent  Omega Biotek 公司開發(fā)的腐殖酸吸附劑,能去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無醇的硅膠柱純化方式,可去除土壤中各種可溶性金屬鹽,以及其它可溶性的抑制因子。該試劑盒已經(jīng)成功地提取如下土壤 ( 部分是客戶反饋 ) :自然保護區(qū)森林的土壤 ( 長達 30-40 年森林土壤,表層有 30 -50cm 落葉層 ) ,紅樹林土壤,草地,耕地,海底泥,污泥,礦石區(qū)泥土,有機物污染的泥土,池塘泥,垃圾泥,空調(diào)管道堆積物等。  

 

實驗方法  

為表明該試劑盒的優(yōu)勢性,我們選擇以下不同組織樣品進行 DNA 提取實驗,每個樣品重復(fù) 3 次。  

l           森林類樣品:自然保護區(qū)森林土壤 ( 廣東黑石頂自然保護區(qū) ) 和海南島紅樹林保護區(qū)  

l           礦石區(qū)樣品:礦石區(qū)水底土壤 (  ) 和礦石區(qū)地表土壤 (  )  

l           耕地樣品:稻田土壤,菜地土壤  

l           有機物污染地表樣品:污水溝衍泥和生活垃圾堆放區(qū)  

 

操作方法(按 Soil DNA Kit 試劑盒進行)簡單描述以下:  

1.          取▲ 0.5 g 森林土壤 / 耕地土壤 ,或  4g 礦石區(qū)土壤和有機物污染土壤至 15ml 離心管中;  

2.          加入▲ 0.5g 酸洗玻璃珠,或  4g 酸洗玻璃珠;  

3.          加入▲ 1ml Buffer SXL MLus ,或  8 ml Buffer SXL MLus   

4.          立即在渦旋儀上gao速渦旋 3 分鐘。  

5.          加入▲ 100ul   ,或◆ 800ul Buf fer DS ,渦旋 15s 混勻  

6.          轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至 70 oC 水浴鍋中,水浴 10-15 分鐘。  

7.          3000 x g 離心 3 分鐘,轉(zhuǎn)移▲ 800ul ,或◆ 7 ml 上清,并加入▲ 270ul Buffer SP2 或◆ 2.3 ml Buffer SP2 ,渦旋混勻;  

8.           10,000 x g 離心 5 分鐘,或  5 , 000 x g 離心 10 分鐘;  

9.          把上清液轉(zhuǎn)稱至新的 2ml/15ml 離心管中,加入 0.7 倍的異丙醇。 ( 在處理礦石區(qū)樣品時和有機物污染的樣品中,還加入 133ul 糖原溶液 ),渦旋混勻;  

10.        10,000 x g 離心 5 分鐘,或  5 , 000 x g 離心 10 分鐘沉淀收集 DNA   

11.       倒棄上清液,并反扣于吸水紙上 5 分鐘;  

12.       加入 200 ul Elution Buffer ,渦旋 5 秒。 5  水浴 20-60 分鐘,讓 DNA 充分溶液。  

13.       加入 50ul HTR, 反應(yīng) 2min 后,離心,取上清。  

14.       上清加入等體積(約 200ul  XP2 Buffer ,均勻后上柱。  

15.       加入 300ul XP2 Buffer ,洗滌一次。  

16.       加入 700ul SPW Wash Buffer ,洗滌兩次。  

17.       空甩后,加入適當量的 Elution Buffer 洗脫即可。  

 

實驗結(jié)果  

1.        DNA 電泳結(jié)果  

 10 ul 純化的基因組 DNA 上樣于 0.8% 瓊脂糖凝膠, 80V 電泳 30 分鐘,結(jié)果如下。  

 

0.5g 森林類土壤樣品  

( 前兩個自然保護區(qū)森林土壤,后兩個為紅樹林土壤 )  

 

0.5g 耕地類土壤樣品  

A: 水稻田土壤  

B: 玉米土壤  

   

4g 有機物污染土壤樣品  

A: 生活垃圾堆放地  

B: 污水溝底泥  

 

4g 礦石泥  

1  3 是兩個礦石區(qū)水底土壤 (  )  

2  4 礦石區(qū)地表土壤 (  )  

 

2.        DNA 純度和產(chǎn)量分析  

土壤類型  

A260  

A280  

A230  

A320  

A260/A280  

產(chǎn)量 ug  

6  

0.1792  

0.1041<

    

 

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