當(dāng)前位置:上海古朵生物科技有限公司>>公司動態(tài)>>如何選擇對的抗體?
抗體是我們實驗中常用到的檢測試劑,如果實驗室中有驗證好的抗體,可以直接拿來用,是一件非常幸福的事情??扇绻龅叫碌臋z測,面對形形色色的抗體,要如何選出你的 Ab. Right 呢?下面就容小編為你慢慢道來。
抗體,也就是免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig),是由兩條約50kDa的重鏈和兩條 25kDa 的輕鏈通過疏水鍵和二硫鍵的鏈接而構(gòu)成,通過重鏈和輕鏈的N端的可變區(qū)來識別抗原表位(epitope)??乖砦豢梢允沁B續(xù)的氨基酸所構(gòu)成的線性表位,也可以是蛋白質(zhì)折疊后氨基酸序列不連續(xù)但空間接近的構(gòu)象表位。
依據(jù)重鏈的差別,抗體可以分為不同的類和亞類。如人的抗體可分為 IgG,IgA,IgM,IgD,IgE 五類,而 IgG 又可以分為 IgG1-IgG4,四個亞類。我們常用的抗體主要是 IgG 類別的,也有少部分IgM 等其它類別的抗體。
抗體不僅可用于識別蛋白質(zhì),還可以識別多糖,抗生素,DNA 等。如 Active Motif 提供的可識別不同DNA修飾的抗體(anti-5mC,anti-5hmC等)
常見的使用抗體的實驗:
Western blot: 蛋白質(zhì)變性,抗體識別線性表位
IHC/ICC/IF:蛋白質(zhì)固定后經(jīng)過修復(fù),表位可恢復(fù),抗體識別線性表位/構(gòu)象表位
ELISA
FACS 蛋白質(zhì)處于天然狀態(tài),抗體識別線性表位/構(gòu)象表位
Co-IP
ChIP:蛋白質(zhì)經(jīng)過固定處理,部分表位可能被掩蓋或發(fā)生變化,抗體識別線性表位/構(gòu)象表位
簡單的選擇抗體的方式就是查文獻(xiàn)看是否有相同的應(yīng)用,再者是參考抗體公司的檢驗數(shù)據(jù),會列出抗體經(jīng)過哪些實驗技術(shù)的檢驗,以及應(yīng)用相關(guān)技術(shù)所發(fā)表的文章,可幫助決定抗體是否適用并提供參考的稀釋比例。
此外還有其它一些因素在選擇抗體時需要考慮到
1. 一抗的種屬來源:一般的實驗并沒有對一抗的種屬有特定要求,但在免疫組化的實驗中,如選用與組織樣品同物種的一抗,則會因為二抗識別組織中的免疫球蛋白而影響實驗結(jié)果,因而對此類實驗應(yīng)選擇不同物種的一抗。此外,Co-IP 實驗中,由于后續(xù)的 western blot 時樣品中有一抗蛋白的存在,若目的蛋白的大小在 50kDa 左右且與一抗同源,則一抗的重鏈會對結(jié)果造成干擾,因而也應(yīng)避免使用同源一抗。
2.二抗:二抗應(yīng)選擇抗一抗同物種同類免疫球蛋白的抗體,如一抗為小鼠 IgG 類的抗體,則二抗則為抗小鼠 IgG 的抗體。如一抗為 IgG1 亞類,二抗可以針對這個亞類,也可以用對四個亞類都有效的 anti-IgG。在此基礎(chǔ)上,再根據(jù)所需要的標(biāo)記物如酶和熒光基團(tuán)等來確定抗體。
3.單抗/多抗/重組抗體
單抗是指識別單一表位的抗體。目前單抗的生產(chǎn)是將分泌單一抗體的 B 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相融合形成雜交瘤細(xì)胞,通過培養(yǎng)細(xì)胞系來進(jìn)行的。相對于多抗,單抗的特異性較高,雜帶少,在一段時期內(nèi)較為穩(wěn)定。但由于單抗識別的表位單一,若表位因化學(xué)處理發(fā)生變化或表位因蛋白間或蛋白與 DNA 間的結(jié)合被掩蓋,單抗就無法發(fā)揮功能。
多抗,也稱為抗血清或血清型抗體,它是通過純化免疫動物的血清所制備的,可以識別抗原的多個表位,親和性比單抗高,且無表位被掩蓋的顧慮,多抗還可以放大低表達(dá)靶蛋白的信號。但多抗有時也會引入較高的背景信號,在缺乏參考資料的情況下,可以通過 Blast 制備多抗的抗原序列來確定是否存在可能干擾實驗的同源蛋白,另外多抗的不同制備批次間易存在差異。
盡管雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單抗可以在一段時間內(nèi)保持穩(wěn)定的抗體性能,我們的 Active Motif 的科學(xué)家也采取多種措施來保證抗體質(zhì)量,如每次生產(chǎn)的抗體都會對其做嚴(yán)格質(zhì)量檢測;保證低傳代的雜交瘤在液氮中的保存量,杜絕高傳代雜交瘤生產(chǎn)抗體;縮短體外或動物體內(nèi)培養(yǎng)的時間等等。但不可避免的,雜交瘤細(xì)胞系在*培養(yǎng)后會產(chǎn)生返祖現(xiàn)象不分泌抗體或者分泌無意義輕重鏈,降低抗體效價,此時就會更換新的雜交瘤系。所以,如果您已經(jīng)找到適用的單抗/多抗,不妨為為發(fā)表文章/畢業(yè)多儲備兩支。如果實驗室需要*穩(wěn)定無批次差異的高品質(zhì)抗體,那么重組抗體會是一個很好的選擇。
重組抗體:Active motif 的 AbFlex® 重組抗體,是通過獲得高親和性高特異性單抗的基因,構(gòu)建Active Motif的*的抗體表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)。它可以根據(jù)實驗需要靈活選擇抗體標(biāo)記物和純化方式,性能穩(wěn)定,*消除了批次間的差異,并且生產(chǎn)過程中不需要免疫動物,這樣既避免了動物病原體的污染也減少了對實驗動物的傷害。
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