微藻被認(rèn)為是液體生物燃料生產(chǎn)的有希望的候選對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)Tribonema sp.（黃絲藻）在光自養(yǎng)條件下能大量積累脂質(zhì)，還能夠利用葡萄糖作為碳源，是生物柴油生產(chǎn)的jia油源微藻之一。但異養(yǎng)模式會(huì)明顯降低脂質(zhì)含量，因此，確定脂質(zhì)積累和發(fā)育的機(jī)制是十分必要的。測(cè)定光自養(yǎng)和異養(yǎng)生長(zhǎng)之間代謝途徑的差異，將為改善異養(yǎng)細(xì)胞的脂質(zhì)積累提供目標(biāo)和策略。

比較光自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)小型黃絲藻細(xì)胞的生長(zhǎng)、生化成分、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)特征，研究其代謝差異。在比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)在光自養(yǎng)和異養(yǎng)生長(zhǎng)條件下中樞碳代謝和脂質(zhì)生物合成途徑變化的模型。此外，還分析了外源關(guān)鍵代謝中間體的補(bǔ)充對(duì)異養(yǎng)培養(yǎng)中脂質(zhì)積累的具體影響。

研究結(jié)果

1.光自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下小型黃絲藻的生長(zhǎng)及生化成分積累的比較

小型黃絲藻細(xì)胞在生物反應(yīng)器進(jìn)行光自養(yǎng)和異養(yǎng)條件培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)分析隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)黃絲藻的生物干重以及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物占干重的百分比。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在光自養(yǎng)條件下，碳水化合物的生物合成大大降低。作者還測(cè)量了在不同生長(zhǎng)階段的小型黃絲藻細(xì)胞的色素濃度，以評(píng)估不同培養(yǎng)模式的影響。

圖1 小型黃絲藻在光自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)和生化組成積累

2.RNA-seq及碳代謝和脂質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達(dá)的差異

為了鑒定脂質(zhì)積累期間發(fā)生的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，使用光合自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)物的樣品進(jìn)行RNA-seq分析。轉(zhuǎn)錄組拼接產(chǎn)生了58,211個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并對(duì)獲得轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行NR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)▓D2a）和基因本體論（GO）注釋統(tǒng)計(jì)（圖2b）。差異分析結(jié)果表明，與光合自養(yǎng)細(xì)胞相比，異養(yǎng)細(xì)胞中有1032個(gè)上調(diào)基因和1442個(gè)下調(diào)基因。在這些基因中，進(jìn)一步分析了與碳代謝和脂肪酸和三酰基甘油生物合成相關(guān)的差異表達(dá)的基因（DEG）及參與的生化途徑。結(jié)果揭示了異養(yǎng)細(xì)胞中強(qiáng)烈上調(diào)的基因參與糖原異生和TCA循環(huán)，而參與糖酵解，丙酮酸代謝和脂肪酸生物合成的基因被下調(diào)。此外，這些數(shù)據(jù)還揭示了補(bǔ)充碳前體對(duì)于在異養(yǎng)條件下小型黃絲藻細(xì)胞增加脂質(zhì)積累的重要性。

圖2 RNA-seq 轉(zhuǎn)錄本的NR數(shù)據(jù)庫(kù)和GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋統(tǒng)計(jì)

3. 光自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下小型黃絲藻的代謝組學(xué)分析

通過(guò)LC-MS檢測(cè)所有樣品中存在的總共216種一級(jí)和二級(jí)藻類(lèi)細(xì)胞內(nèi)代謝物。隨后，作者構(gòu)建了傳統(tǒng)的主坐標(biāo)分析（OPLS-DA）模型，以研究代謝物水平與培養(yǎng)條件之間的相關(guān)性。模型結(jié)果顯示，兩個(gè)模型在兩組之間的（X軸）方向上顯示出明顯的簇，表明異養(yǎng)培養(yǎng)是造成代謝譜之間的大部分差異的原因（圖3a）。PLS-DA模型的相應(yīng)加載圖，鑒定負(fù)責(zé)觀察到的分離的代謝物（圖3b）。不同培養(yǎng)模式顯著地影響34種鑒定到的代謝物（13種氨基酸，2種糖，7種脂質(zhì)和12種其他物質(zhì)）。

圖3 光自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下小型黃絲藻的代謝產(chǎn)物的PCA分析

4. 異養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄組和代謝組的變化

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)，代謝物分析和生化數(shù)據(jù)，作者提出了在異養(yǎng)條件下脂質(zhì)生物合成的簡(jiǎn)化碳前體方案（圖4）。該方案合理清楚地顯示了從葡萄糖到不同代謝途徑的碳前體的流程，主要是糖酵解/糖異生途徑，TCA循環(huán)和脂肪酸生物合成。 簡(jiǎn)言之，參與糖酵解，脂肪酸和TAG生物合成的關(guān)鍵酶被下調(diào)，而涉及糖異生的關(guān)鍵酶在異養(yǎng)條件下被上調(diào)。盡管異養(yǎng)條件下的大多數(shù)關(guān)鍵代謝物與光合自養(yǎng)條件下的代謝物沒(méi)有顯著差異，但代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，參與糖酵解/糖異生的兩種關(guān)鍵代謝物的水平升高，而參與TCA循環(huán)和脂肪酸生物合成的幾種代謝物呈現(xiàn)低豐度。

圖4 小型黃絲藻的中樞碳代謝通路調(diào)控模型及和脂質(zhì)生物合成方案

5. 異養(yǎng)條件下潛在代謝物對(duì)生物量和脂質(zhì)積累的影響

為了確定代謝物標(biāo)志物是否會(huì)增加小型黃絲藻體內(nèi)脂質(zhì)的積累，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，以不同濃度提供六種潛在代謝物（半乳糖醇，*，N-甲基酪胺，檸檬酸鹽，琥珀酸鹽和棕櫚酸鉀）進(jìn)行了分析。比如圖，b顯示了在異養(yǎng)條件下補(bǔ)充2種糖（*和衛(wèi)矛醇）對(duì)小型黃絲藻的生物量和脂質(zhì)積累的影響。*補(bǔ)充劑不會(huì)引起異養(yǎng)培養(yǎng)物中小型黃絲藻的生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累的顯著變化。如圖5c表明隨著N-甲基酪胺濃度的增加小型黃絲藻的生物量和脂質(zhì)積累略有增加，而圖5e表明棕櫚酸鉀是一個(gè)有效的觸發(fā)器，促進(jìn)異養(yǎng)培養(yǎng)下小型黃絲藻細(xì)胞內(nèi)脂肪積累。

圖5 六種潛在代謝物標(biāo)記物對(duì)異養(yǎng)條件下小型黃絲藻的生物量和脂質(zhì)積累的影響

結(jié)論

小型黃絲藻細(xì)胞中，碳前體供應(yīng)不足導(dǎo)致異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中脂質(zhì)積累水平較低。根據(jù)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，適當(dāng)補(bǔ)充碳代謝物可促進(jìn)脂質(zhì)積累。此外，還通過(guò)組學(xué)分析確定了基因調(diào)控代謝靶點(diǎn)。