流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書

1.試劑盒簡介貨

流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒主要感染當(dāng)年草魚種和青魚，死亡率可達(dá)80%以上。其它淡水鯉科魚，如鰱魚、鳙魚、鯽魚、鯉魚感染后沒有臨床癥狀，但可以攜帶病毒到處傳播。該病在水溫高于20℃以上時(shí)流行, 25～28℃為流行高峰。常見的臨床癥狀為眼突出、體色發(fā)黑，口腔、鰓蓋和鰭條基部出血。撕開表皮，可見肌肉出現(xiàn)點(diǎn)狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝、脾充血或因失血而發(fā)白。病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）,是水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）的成員。病毒為直徑70nm的球形顆粒，有雙層衣殼，無囊膜，含有11個(gè)片段的雙鏈RNA。根據(jù)片段長度大小分為大（L1、L2、L3，大小在4.0kb～3.7kb）、中（M4、M5、M6，大小在2.5～2.0kb）、?。⊿7、S8、S9、S10、S11, 大小在1.6～1.0kb) 三組。在不同地區(qū)存在抗原性、核酸電泳圖譜、對細(xì)胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個(gè)典型的代表株：GCRV-873為湖南株，能在CO、CIK等細(xì)胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE，癥狀以內(nèi)臟出血為主；GCRV-9014為湖北株，能在CIK、CO細(xì)胞中大量增殖，但不產(chǎn)生CPE，癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%。為了適應(yīng)草魚出血病（GCRV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴(yán)格依據(jù)SN/T3584-2013草血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，在本公司嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求。本試劑盒具有快速靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全、操作簡單、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。

2、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑。具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

試劑盒組成成分 體積

*： 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）

3、樣本采集,存放及運(yùn)輸

3.1流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。

取新鮮魚類組織臟器（肝、腦、脾、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS 混勻，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用?；蛉∮锌梢杉?xì)胞病變的細(xì)胞懸液用于檢測。

3.2存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融 3 次）。

3.3運(yùn)輸：采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

4、一步法 RT-PCR 檢測

4.1操作方法

4.1.1樣本的處理（在樣本制備區(qū)進(jìn)行）：

4.1.1.1取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L，一份樣本換用一個(gè)吸頭，再加入 200 ?L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷）， 做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸出中間層，顛倒混勻。

4.1.1.4于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％ 乙醇，顛倒洗滌。

4.1.1.5于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號(hào)：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取核酸】。

注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

4.2、試劑準(zhǔn)備

4.2.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后，2 000 r/min 離心5 s。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制見下表2。

表 2 每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個(gè)一步法RT-PCR管中各分裝15 μL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

4.2.2加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋緊管蓋，500 r/min離心30s。

4.3、檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置如下： 一階段：42 oC/30 min；

第二階段：94 oC/4 min；

第三階段：94 oC/1 min, 55 oC/1 min，72 oC/1 min, 30個(gè)循環(huán)； 第四階段，72 oC/8 min；

第五階段，4 oC 保存。

4.4、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）熒光 PCR 檢測試劑盒瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。

5、結(jié)果判定

5.1一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條320bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2待測樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶，可判陽性。

6、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’