發(fā)光細(xì)菌法(Microtox)是環(huán)境樣品毒性檢測的生物測試技術(shù)，并已被列入德國國家標(biāo)準(zhǔn)(DIN38412)和標(biāo)準(zhǔn)(ISO11348)。毒性是一項(xiàng)綜合的生物學(xué)參數(shù)，它是衡量樣品對活性生物體所產(chǎn)生的影響，不能以化學(xué)分析的方法進(jìn)行測定，而其他的生物測試方法如魚類試驗(yàn)、浮游動物試驗(yàn)、藻類試驗(yàn)等則較為復(fù)雜，且必須使用高等生物進(jìn)行試驗(yàn)，從而引起眾多的爭議。發(fā)光細(xì)菌測試使用了具有發(fā)光特性的天然微生物，而毒性物質(zhì)則將抑制起發(fā)光，且毒性越強(qiáng)光抑制越明顯，這一方法經(jīng)研究被證實(shí)具有快速、簡便的特點(diǎn)，同時(shí)有很好的靈敏度和可靠性。另外，發(fā)光細(xì)菌本身沒有危害性。
發(fā)光細(xì)菌毒性檢測的整個(gè)過程在60分鐘之內(nèi)，發(fā)光抑制率通過測定起始和終止?fàn)顟B(tài)時(shí)的細(xì)菌發(fā)光值并計(jì)算得到，測試的結(jié)果有如下兩種：
l光抑制率，通過計(jì)算直接測定樣品的毒性
l稀釋因子GL，在DIN的分析中，將樣品稀釋成系列濃度并測定每個(gè)稀釋濃度的抑制率，其中造成20%或20%以下抑制率的樣品稀釋度即為GL
德國政府的相關(guān)法規(guī)及應(yīng)用
化學(xué)工業(yè)的廢水、填埋場滲出液和工業(yè)冷卻水必須通過發(fā)光細(xì)菌的毒性測試。同時(shí)，德國聯(lián)邦環(huán)境部門正在起草制定合適的指導(dǎo)性技術(shù)，從而對其他的工業(yè)部門進(jìn)行監(jiān)督。發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)是取代魚類毒性試驗(yàn)的方法之一，并且已在Bavarian地區(qū)進(jìn)行了試點(diǎn)。
德國水管理法(WHG)規(guī)定對填埋廠滲出液和工業(yè)冷卻水進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性測試，這些廢水的毒性將造成嚴(yán)重的問題，如生物污水處理系統(tǒng)和地表水的破壞，因此，WHG明確規(guī)定了廢水排放的毒性限制：
l填埋場滲出液經(jīng)常具有較嚴(yán)重的污染，GL=4
l工業(yè)冷卻水的污染部分是由于生物殺滅劑，GL=12
l現(xiàn)在起，化學(xué)工業(yè)的廢水也被規(guī)定進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性測定，GL=32
廢水監(jiān)測的目標(biāo)是含蓋90%以上的部門，包括醫(yī)院廢水(其中被發(fā)現(xiàn)存在毒素)，大量使用清潔劑和表面活性劑的部門(如食品和飲料業(yè))，石油工業(yè)等。根據(jù)WHG的規(guī)定，必須對20個(gè)以上的部門所排放的廢水以魚類試驗(yàn)進(jìn)行毒性監(jiān)測，Bavaria地區(qū)于1993年起采用了發(fā)光細(xì)菌和Daphania的試驗(yàn)代替魚類試驗(yàn)，該模式現(xiàn)在已被全德國所接受，其結(jié)果等同于魚類試驗(yàn)。在魚類試驗(yàn)、浮游動物試驗(yàn)、藻類試驗(yàn)和發(fā)光細(xì)菌的毒性測試比較中，發(fā)光細(xì)菌法為敏感，被測出毒性的廢水比例高。
表1. 不同工業(yè)部門發(fā)光細(xì)菌毒性檢測的規(guī)定(德國聯(lián)邦環(huán)境辦公室，1998)
| 廢水來源 | 目前的要求(GX) | 目標(biāo)要求(GL) |
| 城市廢水 | GF=2 | 8 |
| 涂料及涂料樹脂業(yè) | GF=2 | 256 |
| 纖維板材料業(yè) | GF=2 | 12 |
| 陶瓷業(yè) | GF=2 |
|
| 制糖業(yè) | - | 4 |
| 纖維、板材、造紙業(yè) | GF=2 | 12 |
| 尸體處理 | GF=8 | 4 |
| 混合廢水 | GF=2, GD=8, GA=16 GL=32, GM=1.5 | 12 |
| 皮革業(yè) | GF=2/4 | 3 |
| 礦砂業(yè) | GF=4 | 32 |
| 水處理 | GL=12 | 2 |
| 紡織業(yè) | GF=2/3 | 4 |
| 有色金屬業(yè) | GF=4 | 24 |
| 金屬業(yè) | GF=2/4/6 | 12 |
| 玻璃、礦物業(yè) | - | 16 |
| 化學(xué)纖維、膜工業(yè) | GF=2 | 96 |
| 煤炭業(yè) | GF=2 | 16 |
| 填埋場滲出物 | GF=2, GL=4 | 12 |
| 干洗及工業(yè)洗衣業(yè) | - | 256 |
| 食品產(chǎn)業(yè) | - | 96 |
| 飲料業(yè) | - | 64 |
| 石油化工 |
| 512 |
GX: 稀釋因子，樣品不產(chǎn)生毒性效應(yīng)的
GF: 魚類試驗(yàn)，GD: daphania試驗(yàn)，GA: 藻類試驗(yàn)，GL: 發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)
歐盟和美國的相關(guān)政府指導(dǎo)性文件：
歐盟關(guān)于邊界河流水質(zhì)控制的指導(dǎo)性文件：
由于毒性物質(zhì)排放所造成的污染，所以需通過生物試驗(yàn)對環(huán)境水樣、沉積物、流出物進(jìn)行毒性測定，從而為環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的安全提供早期的預(yù)警。環(huán)境樣品毒性測定所選用的方法所要考慮的因素包括：方法的靈敏度、快速性，方法要能覆蓋較廣范圍的化學(xué)毒性物質(zhì)。其所列出的排放物、環(huán)境水、沉積物的毒性測試方法包括發(fā)光細(xì)菌法(Microtox)、浮游生物(D.magna)、藻類、魚類試驗(yàn)等，其中Microtox方法的特點(diǎn)是反應(yīng)快速、操作簡便。
美國*(EPA)全廢水毒性試驗(yàn)：污染物測定程序的指導(dǎo)性文件：
EPA對于排放物的控制的經(jīng)典方法是實(shí)行對特定化學(xué)物質(zhì)的指標(biāo)限制，但是在實(shí)際的環(huán)境樣品中人仍存在很多未知的化合物，另外，化合物的毒性效應(yīng)是所有組成物質(zhì)拮抗作用或抑制作用的綜合結(jié)果，所以單純的化學(xué)物質(zhì)的限定不能為水體的安全提供充分的保障。在此情況下，EPA和各州的*正開始使用生物學(xué)的方法對排放物的毒性進(jìn)行測定（而不是傳統(tǒng)的毒物的化學(xué)分析），從而終判定環(huán)境樣品的綜合毒性效應(yīng)。EPA在1994年所頒布的“全廢水毒性控制方案”即指出采用毒性指標(biāo)來控制通過NPDES程序的污染物的排放。方案指出，流出物的生物毒性檢測是水質(zhì)控制的重要方面。關(guān)于生物試驗(yàn)的方法，目前有魚類試驗(yàn)、浮游動物試驗(yàn)等，雖然Microtox試驗(yàn)尚未列入正式的測試方法，但EPA已經(jīng)指出該方法可以作為一項(xiàng)毒性篩選試驗(yàn)，并且承認(rèn)其是一種有效的毒性檢測的工具。
使用發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行毒性檢測的原因：
發(fā)光作用是發(fā)光細(xì)菌正常生理狀態(tài)下所具有的性質(zhì)，它是細(xì)胞呼吸作用的副產(chǎn)物，而呼吸作用則是細(xì)胞和生物代謝的基本過程，細(xì)菌的發(fā)光直接和其呼吸相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞活性受到毒性物質(zhì)作用后，其活性將受到抑制，從而使呼吸速率下降，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)光降低，樣品的毒性越強(qiáng)，發(fā)光細(xì)菌的光損失越多，以細(xì)菌發(fā)光法測定樣品的毒性已經(jīng)被證明是一種方便、可靠的生物傳感方法。
Microtox急性毒性檢測系統(tǒng)概述：
該系統(tǒng)使用凍干的發(fā)光細(xì)菌制劑，通過15分鐘的暴露試驗(yàn)，測定其代謝的抑制情況，從而計(jì)算出樣品（水樣、土壤樣品）的毒性。該方法以通過工業(yè)、研究和政府的試驗(yàn)被證實(shí)有效，至今，已有超過500的關(guān)于Microtox系統(tǒng)應(yīng)用和評價(jià)的論文。同時(shí)該測試方法已在多個(gè)國家被認(rèn)可為標(biāo)準(zhǔn)，包括ASTM(D-5660)。ISO11348-3（水質(zhì)測定—水樣對于發(fā)光細(xì)菌的抑制效應(yīng)測定）的草案也已經(jīng)得到批準(zhǔn)。加拿大已經(jīng)批準(zhǔn)該方法為常規(guī)的測試應(yīng)用于石油鉆井中的排水監(jiān)測。另外，這一方法已被提交美國*作為全廢水毒性測定(WET)的測試，從而作為國家污染和排放物減除系統(tǒng)(NPDES)中一項(xiàng)新方法。
Microtox試驗(yàn)的靈敏度：
目前，公開的數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)保存了1200種以上化學(xué)物質(zhì)的Microtox測試的EC50值。
Microtox試驗(yàn)的準(zhǔn)確性：
Microtox試驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行了充分的重復(fù)性試驗(yàn)，包括實(shí)驗(yàn)室間的比較，證實(shí)其變異系數(shù)在20%以內(nèi)，與化學(xué)分析方法類似，明顯優(yōu)于其他生物學(xué)測試。
Microtox試驗(yàn)的應(yīng)用：
該方法已廣泛、成功地應(yīng)用于環(huán)境和過程的監(jiān)測，具體包括：
l污水處理場的流入液的檢測，以保護(hù)活性污泥的生物活性；
l污水處理廠的流出液的檢測，以保護(hù)受納水體的安全；
l毒性減低評價(jià)(TRE’s)和毒性鑒定評價(jià)(TIE’s)；
l表層水的監(jiān)測以確定點(diǎn)源污染和非點(diǎn)源污染；
l生飲水的檢測；
l沉淀物的測定；
l土壤污染的檢測及其恢復(fù)過程的監(jiān)測；
l工業(yè)過程中水體中生物殺滅劑的檢測
關(guān)于使用Microtox試驗(yàn)進(jìn)行飲用水監(jiān)測的情況：
使用Microtox試驗(yàn)監(jiān)測飲用水的原因：
Microtox試驗(yàn)是建立在生物傳感器基礎(chǔ)上的毒性檢測系統(tǒng)，它能有效地檢測突發(fā)性或破壞性的水源污染，已有多個(gè)國家將該系統(tǒng)應(yīng)用于飲用水的監(jiān)測。在美國，城市中偶發(fā)的和蓄意性的污染特別引起關(guān)注，本方法可以在15分鐘內(nèi)快速地完成檢測，從而對水質(zhì)的變化作出迅速的反應(yīng)，另外，Microtox試驗(yàn)快速篩選結(jié)果的可靠性及其操作的簡便性、成本的合理性也使之成為重要點(diǎn)源上水質(zhì)的常規(guī)監(jiān)測的有效手段。
Microtox試驗(yàn)對特定情況下的飲用水的檢測：
美國*的供水系統(tǒng)和華盛頓地區(qū)的供水管道都使用該檢測方法對飲用水進(jìn)行監(jiān)測，從而保護(hù)平民和軍事人員免受引水污染的危害。
1984年洛山磯和1996年亞特蘭大奧運(yùn)會期間、1991年海灣戰(zhàn)爭以及2000年民主黨全國代表大會期間都采用了該方法對飲用水的處理和分配系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測，以保證飲水的安全。
Microtox試驗(yàn)的檢測范圍：
經(jīng)過近20年的科學(xué)研究，已經(jīng)證明該方法對數(shù)千中不同類型的化學(xué)物質(zhì)具有敏感的效應(yīng)，其反應(yīng)的毒性物質(zhì)包括重金屬、農(nóng)藥、真菌殺滅劑、殺鼠劑、有機(jī)溶劑、工業(yè)化合物等。
下表列出了部分毒性物質(zhì)及其Microtox試驗(yàn)的檢測限
| 砷 | 7.8ppm | 鉛 | 0.6ppm |
| 甲苯 | 1ppm | 汞 | 0.07ppm |
|
| 22.1ppm | 硒 | 33ppm |
| 氨 | 2ppm | 鉻 | 15.3ppm |
| 氰化苯甲酰 | 6.2ppm | 銅 | 0.8ppm |
| DDT | 7ppm | 月桂酸鈉 | 1.2ppm |
| 甲醛 | 3ppm | 六氯化苯 | 11ppm |
| 胺甲萘 | 2ppm | 甲酚 | 1.5ppm |
| TNT | 19.7ppm |
| 1.52ppm |
| 百草枯 | 2.8ppm |
| 1.54ppm |
| 奎寧 | 3.5ppm | 棒曲霉素 | 7.5ppm |
| PCP | 0.7ppm | 二嗪農(nóng) | 1.7ppm |
| 尼古丁 | 0.12ppm | 鎘 | 20ppm |
不使用直接化學(xué)分析的原因：
對于綜合性樣品的處理研究表明，特異性化學(xué)分析測定未知樣品的毒性僅占毒性檢測的20%，化學(xué)分析雖然靈敏、準(zhǔn)確，但由于時(shí)間、費(fèi)用以及對樣品的不可知性使其在毒性的實(shí)際篩選中受到很大限制，另外，混合樣品中不同的化合物彼此之間存在著協(xié)同或拮抗作用，所以終的毒性作用并非單一物質(zhì)作用的加減，因此必須使用生物方法對綜合的毒性效應(yīng)（尤其對于未知物）進(jìn)行測定。目前所應(yīng)用的生物檢測主要包括：魚類試驗(yàn)、藻類試驗(yàn)、D.magna試驗(yàn)和Microtox試驗(yàn)，前三種試驗(yàn)周期長、操作復(fù)雜，而Microtox試驗(yàn)解決了上述問題，并且數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性也明顯提高。
測試儀器的簡便性：
Microtox試驗(yàn)所使用的儀器小巧，便于攜帶，可用于實(shí)驗(yàn)室研究和分析，同時(shí)也可在現(xiàn)場或野外進(jìn)行原位即時(shí)的監(jiān)測。
發(fā)光細(xì)菌毒性檢測的原理：
發(fā)光細(xì)菌體內(nèi)的熒光素酶催化熒光素的氧化作用，反應(yīng)如下：
FMNH2+O2+R-CO-H→FMN+R-COOH+H2O+Light
從而產(chǎn)生生物發(fā)光，它直接與細(xì)胞的活性及代謝狀況相關(guān)。毒性物質(zhì)將改變細(xì)胞的狀態(tài)，包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、電子的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、酶及細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這些變化終將導(dǎo)致生物發(fā)光的減弱。通過生物發(fā)光光強(qiáng)的測定即可計(jì)算得到樣品毒性的強(qiáng)弱。
Modern Water公司microtox檢測系統(tǒng)
使用活體生物的檢測技術(shù)是測定水樣和土壤樣品所存在和潛在毒性的*可靠的方法，Modern Water經(jīng)過多年的發(fā)展與改進(jìn)，在生物毒性試驗(yàn)和儀器準(zhǔn)確性結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展了生物毒性檢測系統(tǒng)，使Microtox檢測系統(tǒng)變得更加便攜，。
發(fā)光細(xì)菌毒性檢測近期研究論文：
Microtox試驗(yàn)作為一種新的有效的醫(yī)療儀器和器材的安全檢測方法。
J Biomater Appl 1998 Oct; 13(2): 166-171
城市地下水質(zhì)量快速生物檢測方法的比較，生物檢測能準(zhǔn)確、有效地測定環(huán)境對地下水的毒性影響，而Microtox試驗(yàn)較之D. magna試驗(yàn)具有更好的重復(fù)性。
Chemosphere 2002 May; 47(5): 547-54
廢水毒性的評價(jià)：Microtox試驗(yàn)和活性污泥氧吸收抑制試驗(yàn)的比較，Microtox試驗(yàn)具有很高的靈敏度，是測定污水處理廠廢水毒性的有效工具。
Water Res 2002 Feb;36(4): 919-24
應(yīng)用Microtox試驗(yàn)檢測Albufera國家公園的水質(zhì)毒性
Chemosphere 2002 Jan;46(2): 355-69
檢測藥物在水中的毒性，首先使用Microtox試驗(yàn)對不同的藥劑進(jìn)行毒性試驗(yàn)
J Chromatogr A 2001 Dec 14;938(1-2):187-97
三種商品化生物發(fā)光毒性檢測系統(tǒng)對化學(xué)毒性的測定
Water Res 2001 Oct;35(14):3448-56
運(yùn)用生物發(fā)光毒性檢測技術(shù)對石油污染的土壤進(jìn)行生態(tài)危害評價(jià)
Environ Toxicol Chem 2001 Jul;20(7):1438-49
金屬工廠廢水毒性測定方法的比較，Microtox試驗(yàn)和魚類試驗(yàn)
兩者具有很好的相關(guān)性，而Microtox試驗(yàn)更適合于工業(yè)廢水的監(jiān)測
Environ Toxicol 2001;16(2)136-41
Microtox試驗(yàn)對于有機(jī)磷殺蟲劑及其代謝產(chǎn)物毒性的研究
Aq. Tox. 1994: 30(3):259-270
發(fā)光細(xì)菌毒性檢測研究報(bào)告：
美國能源部Los Alamos實(shí)驗(yàn)室(LANL)使用Microtox試驗(yàn)對特殊的含放射性物質(zhì)的污水排放物進(jìn)行原位的快速監(jiān)測，結(jié)果也證明了該方法的靈敏、快速以及分析成本較低、操作簡便。
法國環(huán)境科學(xué)中心毒理實(shí)驗(yàn)室對Microtox試驗(yàn)和D.magna試驗(yàn)進(jìn)行了比較，對39種化合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩者的一致率達(dá)86%，而Microtox試驗(yàn)更為方便，更適合對工業(yè)排放物進(jìn)行毒性篩選。
瑞士實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明，Microtox試驗(yàn)?zāi)軌蚝芎玫販y定土壤中殘留的農(nóng)藥及其主要代謝產(chǎn)物的毒性。
科威特地球環(huán)境科學(xué)研究部門的環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用Microtox試驗(yàn)對排放入Shuaiba灣的工業(yè)廢水對海水所造成的毒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)部分樣品產(chǎn)生中等的毒性效應(yīng)，并有季節(jié)性的變化。
荷蘭阿姆斯特丹的Omegam環(huán)境研究所運(yùn)用Microtox試驗(yàn)等的毒性實(shí)驗(yàn)方法對阿姆斯特丹地區(qū)9個(gè)淡水系統(tǒng)的沉積物的孔隙水(pore water)進(jìn)行毒性檢測研究，其中3個(gè)根據(jù)荷蘭污染控制法的規(guī)定要求存在較嚴(yán)重的污染。
香港科技大學(xué)生物研究中心運(yùn)用Microtox試驗(yàn)對維多利亞港的海水沉積物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其中部分樣品存在重金屬污染所造成的毒性。
意大利米蘭的水研究所使用Microtox試驗(yàn)對意北部的Orta湖的沉積物進(jìn)行了毒性研究，發(fā)現(xiàn)人造纖維工廠附近的區(qū)域由于銅和氨的排放，孔隙水中有較明顯的毒性。
密歇根大學(xué)的研究人員應(yīng)用Microtox試驗(yàn)、D.megna試驗(yàn)和Chironomus tentans試驗(yàn)對底特律河的沉積物的毒性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示Microtox試驗(yàn)的時(shí)間短也為敏感。
巴爾第摩水與廢水局面對隨時(shí)可能的毒性物質(zhì)的超標(biāo)排放，開始執(zhí)行排放物的毒性控制以保證水質(zhì)，毒性排放監(jiān)測的方法中即包括了Microtox試驗(yàn)。
西班牙*門的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境水體中包含了很多未知的組成物質(zhì)，其效應(yīng)是多種因素的綜合作用，因此其對環(huán)境的危害性影響的判別很復(fù)雜，而Microtox試驗(yàn)是對混合樣品的毒性進(jìn)行評價(jià)的很好工具。
荷蘭的公共健康和環(huán)境保護(hù)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用Microtox試驗(yàn)對萊茵河的河水進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，由于試驗(yàn)只需15分鐘，因此如發(fā)現(xiàn)毒性問題，可立即采取措施，是河水在進(jìn)入荷蘭后其毒性物質(zhì)和作用逐步降低。
美國*的一項(xiàng)研究報(bào)告指出，暴風(fēng)雨引起的污水存在一定的毒性，使用Microtox試驗(yàn)對其進(jìn)行的研究表明，9%的暴風(fēng)雨污水(stormwater)經(jīng)分析具有顯著的毒性效應(yīng)。
以色列的研究人員的研究結(jié)果認(rèn)為Microtox試驗(yàn)由于其經(jīng)濟(jì)性和管理操作的可行性，因此是工業(yè)園區(qū)污染源監(jiān)控處理的一種有效工具。
美國的研究發(fā)現(xiàn)家禽養(yǎng)殖場除了營養(yǎng)物質(zhì)以外還包含了許多毒性化學(xué)物質(zhì)，通過發(fā)光細(xì)菌的毒性試驗(yàn)可以快速地發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場排放和滲出液中所存在的毒性。
美國海洋資源部門對船塢滲出液的研究發(fā)現(xiàn)木材防腐劑存在著毒性作用(Microtox試驗(yàn))，從而對河口水環(huán)境造成污染。
在水質(zhì)監(jiān)測分析方面，發(fā)光細(xì)菌法(Microtox)以其快速篩選，結(jié)果的可靠性及其操作的簡便性、成本的合理性等優(yōu)點(diǎn)，必將為水質(zhì)的監(jiān)測，帶來便利以及更美好的前景。
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