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如何選擇合適的液相色譜柱

閱讀:236      發(fā)布時(shí)間:2021-6-22
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    C-18和C-8硅烷色譜柱是高效液相色譜(HPLC)中使用的色譜柱,而且,在美國市場(chǎng)上有多于100種C-18和C-8色譜柱出售。面對(duì)這么多可供選擇的色譜柱,分析工作者很難從中選出適當(dāng)?shù)纳V柱來具體使用,同時(shí)更難選擇出一根合適的替換柱。
對(duì)于非極性樣品(如小分子芳烴)或弱極性樣品(如對(duì)羥基苯甲酸酯),C-18和C-8色譜柱是最容易選擇的。對(duì)于這類樣品,色譜柱之間的主要差異在于保留因子(k);而在選擇性方面卻只有微小的差異。但對(duì)于極性和中等極性樣品色譜柱的選擇卻相當(dāng)困難。例如含氨基或酸性基團(tuán)的藥物化合物。分析工作者會(huì)發(fā)現(xiàn)極性樣品在保留時(shí)間、選擇性和峰形都有很大的差別。
  色譜柱的選擇性和峰形受到擔(dān)體硅膠的影響遠(yuǎn)大于鍵合相的影響。另外,有研究報(bào)道在反相色譜中表面硅烷醇、硅酸及金屬雜質(zhì)的影響。在特殊情況下,選擇性的差異可由填料制備時(shí)使用的鍵合過程決定的。
通常情況下,色譜工作者選擇HPLC色譜柱是通過比較由色譜柱供應(yīng)商所提供的填料介質(zhì)的規(guī)格來決定的。這些規(guī)格內(nèi)容包括:表面積、末端封尾、含碳量、顆粒形狀、顆粒尺寸、孔徑、孔容積、裝填密度和鍵合度。含碳量和鍵合度僅由色譜制造商提供,沒有這些規(guī)格使用者不可能計(jì)算出碳的克數(shù),也不可能計(jì)算出一根色譜柱中鍵合相的微分子數(shù)。分析工作者可使用這兩個(gè)數(shù)據(jù)來估計(jì)一根色譜柱的疏水性質(zhì)。然而,即使制造商提供所有上述規(guī)格數(shù)據(jù),使用者也不可能精確地預(yù)測(cè)出色譜柱對(duì)含有極性官能團(tuán)的化合物的選擇性。
  由于色譜的保留時(shí)間是基于分析物和填充基質(zhì)之間許多微妙的相互作用,我們建議使用混合物測(cè)試來比較填充基質(zhì)的規(guī)格與性能。Engelhardt 和他的同伴回顧了硅烷反相色譜的特性,并且提出用溶解物試驗(yàn)來描述固定相的疏水性和親硅基醇特性。另外有一些人也改進(jìn)了測(cè)試條件和方法來解釋那些色譜數(shù)據(jù),但他們只測(cè)試了很少的商品色譜柱,并且在他們的測(cè)試混合物中沒有羧酸。在本文中,我們使用了一個(gè)含有羧酸的測(cè)試混合物來收集了86根C-18和C-8硅烷色譜柱(見表1)的數(shù)據(jù)。我們將測(cè)試結(jié)果詳細(xì)描述如下。表1:研究中所使用的色譜柱的生產(chǎn)商(略)。
  在我們的比較中,我們使用了含有6種物質(zhì)的測(cè)試混合物,此6種物質(zhì)列于圖1。每一種物質(zhì)在測(cè)試混合物中都起特殊的作用。尿嘧啶是用于產(chǎn)生空體積。甲苯是測(cè)試色譜柱的疏水性。吡是用來測(cè)試硅醇基對(duì)堿性物質(zhì)的活性的堿性胺類物質(zhì)。苯酚是一種弱酸,用于與吡啶聯(lián)合起來確定活性擔(dān)體硅的數(shù)量。4-正丁基苯甲酸是一種用于測(cè)試硅醇基對(duì)酸性物質(zhì)的活性羧酸,此方面是色譜柱制造者開發(fā)堿性去活色譜柱來作胺類物質(zhì)分析時(shí)經(jīng)常忽略的。
  我們使用的流動(dòng)相是含有65%的乙腈和35%的濃度為0.05M的磷酸鉀混合溶液,pH值為3.2。pH=3.2的緩沖溶液可使4-正丁基苯甲酸質(zhì)子化,同時(shí)可提高吡的保留時(shí)間的重現(xiàn)性。我們發(fā)現(xiàn)使用沒有加緩沖溶液的流動(dòng)相,如65%乙腈和35%水,即使我們使用同一瓶流動(dòng)相,也無法得到重現(xiàn)性較好的保留時(shí)間和峰形。高離子強(qiáng)度的緩沖溶液,如本次測(cè)試所使用的0.05M的緩沖溶液,會(huì)抑制一些硅醇基的活性(2,5),但對(duì)于將胺從一些非堿性去活的反相色譜柱中洗脫下來,有一些抑制作用是必要的。
我們測(cè)試過另外兩種緩沖溶液,但它們的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸鉀溶液。0.01M磷酸鉀緩沖溶液在pH=3.2時(shí),胺類化合物在有些色譜柱中產(chǎn)生前移峰。0.05M磷酸鉀緩沖溶液在pH=7時(shí),胺類物質(zhì)產(chǎn)生的峰形比在pH=3.2時(shí)更好。吡的pKa均大約為5.2;因此,這些組分在pH=7時(shí)未質(zhì)子化并且呈中性,同時(shí)并不與強(qiáng)酸性的硅醇基發(fā)生離子交換作用。

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