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HPLC法測(cè)定*

實(shí)驗(yàn)原理：樣品中的維生素A 及維生素E 經(jīng)皂化處理后，將其不可皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用液相色譜法C18反相柱將維生素A 和維生素E 分離，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定。該法zui小檢出量分別為：VA：0.8ng ；α-E：9l.8ng ；γ-E：36.6ng ；δ-E：20.6ng.
三、儀器和試劑
儀器
LC-500液相色譜儀帶SPD-500紫外分光檢測(cè)器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、高速離心機(jī)；小離心管：具塑料蓋1.5~3.0mL塑料離心管（與高速離心機(jī)配套）、高純氮?dú)?、恒溫水浴鍋、紫外分光光度?jì)。
2.試劑
實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。試劑不加說(shuō)明為分析純。
1.無(wú)水yi醚：重蒸，不含有過(guò)氧化物。
過(guò)氧化物檢查方法：用5mL yi醚加1mL 10%*溶液，振搖1min。如有過(guò)氧化物則放出游離碘，水層呈黃色或加4滴0.5%淀粉液，水層呈藍(lán)色。
去除過(guò)氧化物的方法：瓶中放人純鐵絲或鐵沫少許，重蒸yi醚。棄去10%初餾液和10%殘餾液。
2.無(wú)水乙醇：重蒸，不含有醛類物質(zhì)。
檢查方法：取2mL 銀氨溶液于試管中，加入少量乙醇，搖勻，再加入10%氫氧化鈉溶液，加熱，放置冷卻后，若有銀鏡反應(yīng)則表示乙醇中有醛。
銀氨溶液：加氨水至5%銀溶液中，直至生成的沉淀重新溶解為止，再加10%氫氧化鈉溶液數(shù)
滴，如發(fā)生沉淀，再加氨水直至溶解。
脫醛方法：將2g 銀溶于少量水中，4g 氫氧化鈉溶于溫乙醇中，然后將兩者傾入1L 乙醇中，振搖后，放置暗處兩天（不時(shí)搖動(dòng)，促進(jìn)反應(yīng)），過(guò)濾，置蒸餾瓶中蒸餾，棄去初蒸出的50mL。當(dāng)乙醇中含醛較多時(shí)．銀用量適當(dāng)增加。
3.無(wú)水鈉。
4.甲醇：色譜純或分析純重蒸后使用。
5.重蒸水：蒸餾水中加少量*，臨用前重蒸。
6.10%抗壞血酸溶液（W/V）：臨用前配制。
7.50%氫氧化鉀溶液（W/V）
8.維生素A 標(biāo)準(zhǔn)液：*（純度85%）或*乙酸酯（純度90%）經(jīng)皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A 標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1mL 相當(dāng)于1mg *。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度.
9.維生素E 標(biāo)準(zhǔn)液: α-生育酚（純度95%），γ-生育酚（95%），δ-生育酚（純度95%）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E 標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1mg/mL。臨用前用紫外分光光度分別標(biāo)定此三種維生素E 的準(zhǔn)確濃度。
10.內(nèi)標(biāo)溶液：稱取苯并[e]芘（純度98%），用脫醛乙醇配制成每5μg/mL 苯并［e］芘的內(nèi)標(biāo)溶液。
11.pHl－14試紙，
四、操作步驟
（一）樣品處理
1.皂化
稱取1～10g 樣品（含維生素A 約3ng，維生素E 各異構(gòu)體約為40ng）于皂化瓶中，加30mL 無(wú)水乙醇，進(jìn)行攪拌，直到顆粒物分散均勻?yàn)橹埂＜?/span>5mL 10%抗壞血酸、苯并[e]芘標(biāo)準(zhǔn)液2.00mL，混勻。再加10mL50%氫氧化鉀，混勻。于沸水浴回流30min 使皂化*。皂化后立即放人冰水中冷卻。
2.提取
將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL 水分2~3次沖洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用約100mL yi醚分兩次洗皂化瓶及其殘?jiān)?/span>yi醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。
3.洗滌
用約100mL 水分次洗分液漏斗中的yi醚層，直至pH 試紙檢驗(yàn)水層不顯堿性（zui初水洗輕搖，逐次振搖強(qiáng)度可增加）。
4.濃縮
將yi醚提取液經(jīng)過(guò)無(wú)水鈉（約5g）濾入250～300mL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，用約50 mL yi醚沖洗分液漏斗及無(wú)水鈉3次，并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收yi醚，待瓶中剩下約2mL yi醚時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮?dú)獯档?/span>yi醚。加入2.00 mL 乙醇，充分混合，溶解提取物。
5.離心
將乙醇液移入小塑料離心管中，3000rpm 離心5min。上清液供色譜分析。如果樣品中維生素含量過(guò)少，可用氮?dú)鈱⒁掖家捍蹈珊?，再用乙醇重新定容，并記下體積比。
（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
1. 維生素A 和維生素E 標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)定方法
取維生素A 和各維生素E 標(biāo)準(zhǔn)液若干微升，分別稀釋至5.00 mL 乙醇中，并分別按給定波長(zhǎng)測(cè)定各維生素的吸光值。用比吸光系數(shù)計(jì)算出該維生素的濃度。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。將一定量的維生素A、α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚及內(nèi)標(biāo)苯并[e]芘液混合均勻；選擇合適靈敏度，使上述物質(zhì)的各峰高約為滿量程70%，為高濃度點(diǎn)。高濃度的1/2為低濃度點(diǎn)（其內(nèi)標(biāo)苯并［e］芘的濃度值不變）．用此種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色譜分析。維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制是以維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，維生素濃度為橫坐標(biāo)繪制，或計(jì)算直線回歸方程。如有微處理機(jī)裝置，則按儀器說(shuō)明用二點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。
本方法不能將β-E 和γ-E 分開(kāi)，故γ-E 峰中包含有β-E 峰。
（三）液相色譜分析
1.色譜條件（推薦條件）
預(yù)柱：C18 5μm，4mm×10cm；
分析柱：C18 5μm，4.6mm×25cm ；
流動(dòng)相：甲醇：水=98：2；混勻，于臨用前脫氣；
LC-500紫外鹼測(cè)器波長(zhǎng)：300nm；量程0.02；
進(jìn)樣量：20μL 進(jìn)樣定量環(huán)；
流速： 1.65~1.70mL/min
2.樣品分析
取樣品濃縮液20μL，待繪制出色譜圖及色譜參數(shù)后，再進(jìn)行定性和定量。
定性：用標(biāo)準(zhǔn)物色譜峰的保留時(shí)間定性。
定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其含量。或用回歸方程求出其含量。
五、計(jì)算
X=C/m×V×100/1000
X—某種維生素的含量（mg/100g）；
C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到某種維生素含量（μg/mL）；
V—樣品濃縮定容體積（mL）；
m：樣品質(zhì)量（g）。
用微處理機(jī)二點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算時(shí)．按其計(jì)算公式計(jì)算或由微機(jī)直接給出結(jié)果。結(jié)果的允許測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差值≤10%

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