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重要啤酒成分與氣相色譜分析

閱讀:1353      發(fā)布時間:2014-11-1
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      近年氣相色譜法(GC)已成為國內(nèi)啤酒業(yè)的重要儀器分析手段。本文綜述了重要啤酒成分及其GC法分析手段,特別對嚴(yán)重影響啤酒質(zhì)量的重要成分作以介紹,并總結(jié)了國內(nèi)外對其分析測定的GC法。

  國外關(guān)于GC用于啤酒研究的zui早報告發(fā)表于1956年,20世紀(jì)70~80年代,有關(guān)GC在啤酒釀造中的應(yīng)用報告越來越多,分析樣品涉及到大麥、酒花、麥芽、輔料、麥汁、發(fā)酵液、啤酒、酵母及污染菌等,分析組分包括醇類、酯類、酮類、醛類、含硫化合物、酸類、后酒花風(fēng)味、酒花油及非揮發(fā)性組分等。而國內(nèi)啤酒行業(yè)應(yīng)用GC法始于80年代,相關(guān)院校及研究所分析工作者做了一些工作,主要分析啤酒中雙乙酰和低沸點的乙醛、醇酯類等輕組分。90年代各大啤酒集團購置GC儀器,對GC法在啤酒釀造過程中有關(guān)啤酒研究和質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究已開展起來,但其深度和廣度遠(yuǎn)不及國外同行。本文總結(jié)了影響啤酒質(zhì)量的重要組分及其國內(nèi)外較完善的GC分析法,以求對國內(nèi)啤酒行業(yè)的GC色譜分析工作者有所裨益。

  GC法作為啤酒研究和質(zhì)量控制的重要分析手段,首先要考慮樣品的制備?,F(xiàn)有制備方法有四種,包括直接進樣、溶劑萃取、蒸餾和頂空進樣,優(yōu)缺點見下表。

  方法優(yōu)缺點

  1.直接進樣簡單、快速易受非揮發(fā)性分的干擾;

  2.溶劑萃取具選擇性,可濃縮樣品易造成人為污染,費時;

  3.蒸餾樣品分級不*回收,熱分解,費時;

  4.靜態(tài)頂空進樣適于微量組分的檢測樣品取樣量大,受水干擾;

  5.動態(tài)頂空進樣可預(yù)濃縮微量揮發(fā)性組分要求吸咐劑熱穩(wěn)定性好;

  靜態(tài)頂空進樣可直接檢測啤酒中會計師相對高的微量組分,而動態(tài)頂空進樣時,樣品由捕集器中吸附劑所吸附而富集,與毛細(xì)管柱配合使用,克服靜態(tài)頂空進樣的局限性,擴大了檢測組分,提高分離度。Verzele和Sandra建議對低分子量的揮發(fā)物采用靜態(tài)或動態(tài)頂空進樣,中等分子量的揮發(fā)物用二硫化碳提取,高等分子量的揮發(fā)物用連續(xù)的液—液提取。頂空進樣技術(shù),PEG20M和FFAP分析柱,配置氫火焰離子化檢測器(FID)、電子捕獲檢測器(ECD)、火焰光度檢測器(FPD),程序升溫,可分析絕大多數(shù)影響啤酒質(zhì)量的重要組分。

  1、醇類

  醇類是啤酒中重要風(fēng)味物質(zhì),主要有乙醇、醇及芳香醇。乙醇作為酵母的主要終產(chǎn)物,啤酒中含量37000~38000ppm,除氣啤酒可直接進樣,Chromosorb103或GDX—102和103柱,160~190℃恒溫運行,F(xiàn)ID檢測,幾分鐘即出乙醇峰,此法可用于常規(guī)質(zhì)控分析和快速在線乙醇監(jiān)測。

  醇主要包括正丙醇、異丁醇、2—甲基丁醇、異戊醇和苯乙醇。啤酒中醇的標(biāo)準(zhǔn)含量為100~150ppm,醇的測定可由聚乙二醇PEG20M和抗氧化型PEG(FFAP)分析柱,頂空進樣,程序升溫,F(xiàn)ID檢測??晒┻x擇的分析柱有ParmaphPEGDB—WaxParmapaispvmsSE—54HP—20MCarbowax20MHP—FFAPHP—5Supelcowax—10AC20等。

  對羥基苯乙醇和色醇(吲哚醇)賦予啤酒溶劑味、不愉快的苦味、酚味,為非揮發(fā)芳香醇,由乙酸乙酯萃取,添硅酮玻璃柱10%ul—w—98DiatoportS.程序升溫155~295℃,F(xiàn)ID檢測,進行GC定量分析。

  2、酯類

  啤酒中適量的酯類賦予啤酒酯香味,使酒體豐滿協(xié)調(diào)。如過量超過閾值,形成不愉快的香味。啤酒中酯類總量為15~50ppm。酯類常具有這樣或那樣水果味,增強啤酒風(fēng)味,其風(fēng)味指數(shù)(濃度與風(fēng)味閾值比率)越高,啤酒風(fēng)味組成越有效。一般來講乙酸異戊酯是酯味重要組成部分,其次為乙酸乙酯、已酸乙酯和乙酸苯乙酯。

  酯類由醇類和脂肪酸的乙酰輔酶A衍生物反應(yīng)在酵母細(xì)胞內(nèi)形成,各種條件下均可,形成的酯類部分透過細(xì)胞壁,分泌到發(fā)酵液中,部分吸附在酵母細(xì)胞內(nèi)壁,留于細(xì)胞內(nèi),癸酸旨以上的酯類幾乎全在酵母細(xì)胞內(nèi),當(dāng)酵母自溶時,高碳鏈脂肪酸的酯類會釋放出來,作為檢測酵母自溶的重要指標(biāo)。

  酯類測定常使用DB—Carbowax20MHP—FFAPSE—54DB—5等分析柱,與上述醇測定使用柱子相似,實際分析中低沸點的乙醛、醇和酯類往往一同測定,二氯甲烷、乙酸乙酯和二硫化碳萃取樣品,直接或頂空進樣,程序升溫,F(xiàn)ID檢測,進行GC分析。

  3、酮類

  雙乙酰與2.3—戊二酮合稱為連二酮,由于2,3—戊二酮在啤酒中含量較低,一般是0.08ppm,對啤酒風(fēng)味影響較小。而雙乙酰風(fēng)味閾值為0.1ppm,啤酒中其含量超過閾值,具有不愉快的奶酪味、餿飯味。一般啤酒雙乙酰控制在<0.1ppm,啤酒<0.05ppm。乳酸桿菌、足球菌等細(xì)菌污染亦造成雙乙酰升高,而2,3—戊二酮含量很低,如果二者含量都較高,說明是釀造缺陷造成的。酵母發(fā)酵過程中,α—乙酰乳酸經(jīng)厭氧加熱或α—乙酰乳酸脫羧酶作用,形成乙偶姻。啤酒中含量低至1—5ppm,15—20ppm均為正常值,風(fēng)味閾值較高50ppm,對啤酒風(fēng)味影響較小。

  測定聯(lián)二酮的方法是:以丙酮、2,3—已二酮或1,2—二氯丙烷作為內(nèi)標(biāo),填充柱10%PEG20M/ChromosorbW(AW—DWS)60—80目或PEG1500/CarbopackC和毛細(xì)管柱CarbowaxPorapakQ均可選擇,頂空進樣,ECD檢測,可作為啤酒釀造過程中質(zhì)量控制分析。

  4、醛類

  啤酒中醛類來自麥汁煮沸中美拉德反應(yīng)和啤酒發(fā)酵過程中醇類還原。大多數(shù)不飽和醛類作為啤酒氧化和老化風(fēng)味,使啤酒產(chǎn)生多種劣味。對啤酒風(fēng)味和質(zhì)量有重要影響的醛類主要有乙醛、糠醛和反—2—壬烯醛。

  啤酒中含量zui高的主要醛類是乙醛,丙酮酸脫羧而成,風(fēng)味閾值10ppm,發(fā)酵啤酒中含量3.5~15.5ppm,成熟啤酒中含量應(yīng)<10ppm,啤酒中含量<6ppm。乙醛影響啤酒口味的成熟,啤酒中含量>10ppm,產(chǎn)生不愉快的粗糙苦味,含量過高,具有辛辣的腐爛青草味。與雙乙酰和硫化氫共同構(gòu)成嫩啤酒的固有生青味。酵母和麥汁污染雜菌(發(fā)酵單胞菌)亦可增加啤酒中乙醛含量。由于乙醛低沸點高揮發(fā)性,GC直接進樣就可測出。頂空進樣時,使用PEG或FFAP分析柱,F(xiàn)ID檢測,與啤酒中醇和酯類一同測定。

  國外研究表明,糠醛的增加與羰基化合物(主要是醛類)的增加是平行的,因此糠醛水平的變化可指示影響風(fēng)味的羰基化合物的變化,如糠醛含量>100ppb,可作為原始風(fēng)味敗壞的指示信號。Davis和Palamand報告其GC定量測定,由于其高沸點低揮發(fā)性,利用HPLC方法測定。

  反—2—壬烯醛的形成是啤酒老化的主要原因之一,產(chǎn)生的主要機制是脂類和游離脂肪酸的酶促和非酶促氧化,糖化時發(fā)生的不飽和脂肪酸的氧化是zui重要的反應(yīng),zui終導(dǎo)致反—2—壬烯醛的形成,風(fēng)味閾值0.1ppb。測定麥汁過濾后樣品中反—2—壬烯醛方法,麥汁在pH2的條件下回流,用二硫化碳萃取,PEG20M或FFAP柱上分離。B.W.Drose等將樣品經(jīng)Sep—pakC18濃縮,氮氣吹干,正戊烷洗脫,65℃下florox衍生1小時,CP—Sil19CB分析柱,程序升溫180—300℃,ECD檢測,或啤酒的正戊烷提取液,DBWAX分析反—2—壬烯醛及其前體物,為研究啤酒穩(wěn)定性提供分析手段。

  5、酸類

  啤酒中的酸類雖不構(gòu)成啤酒的香味,但是主要呈味物質(zhì),啤酒中的酸類及其鹽類控制啤酒的pH值和總酸含量,適宜的pH值和總酸能賦予啤酒柔和清爽的口感,同時作為重要緩沖物質(zhì),控制啤酒的pH值,利于各種酶的作用。缺乏酸類,啤酒口感呆滯、粘稠、不爽口;過量的酸類使啤酒口感粗糙、不柔和、不協(xié)調(diào),對啤酒香味、起泡特性及酯類形成影響較大。此外酵母和污染菌的脂肪酸分析可作為菌種鑒定指標(biāo),啤酒中有機酸種類和含量是判斷啤酒發(fā)酵是否正常進行和是否污染產(chǎn)酸菌的標(biāo)志。

  啤酒中的酸類約100種,分為不揮發(fā)酸、低揮發(fā)酸和揮發(fā)酸。不揮發(fā)酸主要有乳酸、琥珀酸、焦谷氨酸、檸檬酸、延胡索酸、丙酮酸、草酸、酒石酸、乙醇酸、異檸檬酸、α-酮式戊二酸等;低揮發(fā)酸主要有丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、已酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等脂肪酸;揮發(fā)酸主要有甲酸和乙酸。啤酒中主要脂肪為C6-C10。長鏈不飽和脂肪酸主要來自麥汁C16-C18和酵母糖代謝,麥汁中主要脂肪酸是C16-C18,其中C16:1、C18:2、C18:3為重要不飽和脂肪酸,來源于相應(yīng)的飽和脂肪酸,糖化時在氧的作用下不飽和脂肪酸自氧化和酶促氧化,產(chǎn)生啤酒老化風(fēng)味物質(zhì)——不飽和醛類。酵母自溶導(dǎo)致中鏈脂肪酸如丁酸、異戊酸、已酸、辛酸和癸酸含量增加,對啤酒風(fēng)味影響極大。GC法分析酵母自溶物中脂肪也是十分有意義的。

  David等人將非揮發(fā)性酸類甲基化后經(jīng)氯仿提取,揮發(fā)性酸類經(jīng)乙醚提取,采用玻璃填充柱10%SP10或1%磷酸,100/200目ChromosorbW–AW,115℃恒溫,頂空進樣,F(xiàn)ID檢測,定量分析丙酮酸、乳酸、草酸和琥珀酸非揮發(fā)性酸類及C2-C7低揮發(fā)性酸類。Powell和Vinth等采用二硫化碳萃取直接進樣,F(xiàn)FAP或PEG分析柱,經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定,分離和測定C2-C12脂肪酸。Susan等將樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取,DB-WAX分析柱,L.E.Stenroos等將樣品經(jīng)二氯甲烷萃取,Carbowax20M分析柱,程序升溫,頂空進樣,F(xiàn)ID檢測,與部分醇、酯、酮類一起測定C2-C10脂肪酸。Karen,Macpherson,Chen和Taylor等用氯仿-甲醇溶液萃取,三氟化硼-甲醇進行甲酯化反應(yīng),聚乙二醇或DB-225,10%SPChromasorb柱分離,程序升溫,頂空進樣,F(xiàn)ID檢測,測定啤酒、麥汁和酵母中C8-C18游離脂肪酸。

  6、含硫化合物

  啤酒中的含硫化合物分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性,前者占啤酒中含硫化合物的1%,后者則包括無機硫化硫和含硫氨基酸,作為揮發(fā)性含硫化合物的前體物質(zhì),它們主要來自麥芽、輔料、酒花、釀造水及酵母的硫代謝。啤酒中很多揮發(fā)性含硫化合物是強風(fēng)味低閾值物質(zhì),雖然濃度較低,但對啤酒風(fēng)味的影響很大,特別是一些低分子量的含硫化合物對風(fēng)味的影響更大,而且這些作用常常對啤酒質(zhì)量是有害的。對啤酒質(zhì)量有重要影響的含硫風(fēng)味物質(zhì)主要是二甲基硫(DMS)、SO2、H2S和3-甲基-2丁烯-1-硫醇。

  DMS為陳貯啤酒風(fēng)味的特色組分,標(biāo)準(zhǔn)含量為20~70ppb,過量則有令人不快的腐爛蔬菜/卷心菜味道。麥汁污染細(xì)菌直接產(chǎn)生DMS,DMSzui高可達(dá)200ppb以上。殺菌和啤酒儲存中,啤酒中DMS含量有微量增加。SO2可與羰基結(jié)合形成中性風(fēng)味組分,延遲啤酒風(fēng)味的老化和走味,為了改善啤酒的口味穩(wěn)定性,生產(chǎn)中常常在麥汁制造和濾酒時添加亞硫酸氫鈉、亞硫酸、液態(tài)SO2等,添加量不超過20mg/l,在8~10mg/l。SO2含量小于10mg/l,不會引起不愉快的氣味,過量則會產(chǎn)生硫的口味。啤酒中絕大部分H2S由酵母代謝產(chǎn)生,H2S在啤酒中氣味閾值為5~10ug/l。當(dāng)啤酒中H2S>10ug/l時,啤酒有生酒味;當(dāng)>50ug/l時,有臭雞蛋味,而啤酒中只有1—5ug/l。啤酒中DMS、SO2、H2S可由CarbopakBHT100柱分離,DMS還可由15%PEG1500ChromasorbW80–100目或FaruphPEG柱分離,頂空進樣,F(xiàn)PD檢測,定量GC分析。

  啤酒曝露于350–500nm光下會產(chǎn)生光解物質(zhì)3-甲基-2-丁烯-1硫醇(MBT),此物質(zhì)有硫臭味,風(fēng)味閾值低于0.1ppb,是由酒花苦味成分異α-酸經(jīng)光敏感型的核黃素的光解作用產(chǎn)生的。曝露于日光和人工燈光下的啤酒中已檢測出MBT。光照后啤酒樣品頂空吸附于Chromasorb101柱,解吸附后直接進入填充12%DC-200ChromasorbW氟代乙丙烯聚合物FEP,定量GC分析。

  7、酒花油及后酒花風(fēng)味

  酒花油是啤酒重要的香味來源,來源于酒花及其制品的添加,主要成分為單萜烯和半萜烯、石竹烯、香味烯、律草烯、法呢烯,為碳—氫結(jié)構(gòu)化合物,香氣極不愉快,是生酒花香的來源;碳—氫—氧原子的醇、酮和酯類,如香葉醇和沉香醇具有玫瑰花香、杏木香氣,是啤酒中幽雅香氣的主要成分。酒花品種間酒花油含量和種類是有差異的,以此可作為酒花品種的鑒定。真空蒸餾酒花及其制品的酒花油,要用DB—WAX柱,柱頭進樣,或Parmaphiscms/1701柱,頂空進樣,程序升溫,F(xiàn)ID檢測。陳家華等通過循環(huán)吸咐法采集酒花香氣成分,乙醚洗脫,OV101毛細(xì)管柱,程序升溫,GC/MS定性,共鑒定113種啤酒花香氣成分。

  麥汁煮沸中,單萜烯和半萜烯的碳水化合物一部分隨蒸汽揮發(fā)掉,一部分未變化的萜可產(chǎn)生強烈氣味,口味閾值約5ppb、即可感官測出。麥汁中測出的氧化產(chǎn)物如香葉醇、里哪醇、十一醇、α-萜醇及環(huán)氧化合物環(huán)氧律草烯,將作為微量成分進入啤酒中,zui終啤酒中含有未改變和已轉(zhuǎn)化好的復(fù)雜混合香味組分,稱為后酒花風(fēng)味。正常啤酒中只要含3ppm酒花油,就可感覺到酒花香氣。Shuso等采用Sep-pakC18柱吸附樣品,二氯甲烷洗脫后濃縮,HP-20M分析柱,F(xiàn)ID檢測,定量分析啤酒中里哪醇和環(huán)氧律草烯。

  8.非揮發(fā)組分

  (1)糖類

  麥汁糖化時,淀粉經(jīng)酶促反應(yīng)主要產(chǎn)生可發(fā)酵性糖類,包括單糖(果糖和葡萄糖)、雙糖(蔗糖和麥芽糖)和三糖(麥芽三糖)。經(jīng)酵母發(fā)酵代謝,麥汁中絕大部分可發(fā)酵性糖類轉(zhuǎn)化為各級代謝終產(chǎn)物,形成啤酒中各種風(fēng)味物質(zhì)。麥汁中可發(fā)酵性糖類的合理組成,對研究酵母的降糖性能和形成啤酒特定風(fēng)味有重要影響。發(fā)酵后啤酒中殘留的糖類主要有麥芽糖、麥芽三糖、非發(fā)酵性糖以及甘油,它們組成啤酒中的甜味物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)。

  ASBC建議采用Brobst和LOtt的方法,樣品加到吡啶中,在催化劑三氟乙酸的催化下與六甲基二硅胺反應(yīng),產(chǎn)生的糖類異構(gòu)體,給定性和定量工作增加困難。Jamieson吸取了Brobst的可取之處,采用OV一17SE一30SE一52分析柱,程序升溫,F(xiàn)ID檢測,定量分析可發(fā)酵糖,但啤酒樣品必須干燥。

  (2)氨基酸

  麥汁糖化時,蛋自質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)主要產(chǎn)生18種游離氨基酸,經(jīng)酵母發(fā)酵代謝,麥汁中絕大部分游離氨基酸轉(zhuǎn)化為各級代謝終產(chǎn)物,形成啤酒中各種風(fēng)味物質(zhì)。麥汁中氨基酸的合理組成,對形成雙乙酰、含硫化合物、醇和酯類等風(fēng)味物質(zhì)有重要影響,發(fā)酵后啤酒中殘留的氨基酸可作為啤酒中的營養(yǎng)物質(zhì)。

  測定游離氨基酸將樣品經(jīng)離子交換柱去除不相關(guān)分子,衍生為具揮發(fā)性的三氟代乙基丁酯,串連OV一17/210或ChromasorbW柱,定量分析組氨酸、色氨酸、精氨酸和半胱氨酸,其它氨基酸制成七氟丁酰異戊酯衍生物在SE一30柱上分離。

  (3)酚類

  啤酒中酚類分單體酚和多聚酚,主要來自麥芽和酒花,啤酒中含量25~60ppm和70~100ppm。多酚是啤酒口味助劑,賦予啤酒醇厚性,增強苦味。低分子多酚比高分子多酚沉淀蛋白質(zhì)的能力要強,高分子多酚的活性較差并保留在麥汁中,使啤酒色澤加深和口味粗糙,低分子多酚具有還原性。使啤酒口感新鮮,對啤酒口味穩(wěn)定性有促進作用。多酚被氧化,加深啤酒色度,破壞啤酒膠體穩(wěn)定性,使啤酒苦味變粗糙并產(chǎn)生不愉快的后苦,是啤酒澀味、陳舊味的主要原因之一。酚類與蛋白質(zhì)形成的復(fù)食物,會造成啤酒混濁。包裝后的啤酒在室溫和突然低溫下儲存一定時間,啤酒中的單體酚和多聚酚會與蛋白質(zhì)結(jié)合,產(chǎn)生混濁,混濁產(chǎn)生速率可作為包裝啤酒的貨架壽命指標(biāo)。

  揮發(fā)性酚類可采用蒸汽蒸餾,氧化鋁柱或溶劑萃取濃縮后進樣,氣一液色譜分離測定。非揮發(fā)性酚類多采用離子交換樹脂尼龍一66和PVPP等固體吸附劑,甲醇、乙酸乙酯等溶劑革取,在吡啶中與六甲基二硅氯烷(HMDS)及*基氯硅烷或HMDS一二甲基甲酰胺,制成*基硅醚(TMS)衍生物,可選擇sE一30OV一1Dexsil300GCSE一52分析柱,GC一MS聯(lián)用鑒定啤酒中70多種酚類。

  釀造水、大麥等原料中的余氯會與麥芽中的多酚形成氯酚臭味,細(xì)菌和化學(xué)物質(zhì)污染亦會造成氯,酚臭味,樣品富集后,乙酰化反應(yīng)使弱電負(fù)性的酚類化合物轉(zhuǎn)化為具有強電負(fù)性的酚乙?;苌铮x用OV101SE-300V-10V-17ChromosorbWAWDMCS分析柱,ECD檢測。

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