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該試劑盒以HRP 標記的鏈霉親和素復合物（HRP Streptavidin
Conjugate，HRP-SA）為基礎，可用于檢測細胞、組織內(nèi)的特異性t-PA
抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。
在所用的t-PA 一抗與相應靶抗原結(jié)合后，用生物化二抗與一抗特異
性結(jié)合，zui后加入HRP-SA，形成抗原—特異一抗—*化二抗—
HRP-SA 復合物，顯微鏡下觀察成像。
注：本產(chǎn)品僅供實驗室科學研究。本步驟是根據(jù)我們*實驗得出的
有效步驟，不一定是*方法，請客戶根據(jù)具體科研實驗情況進行調(diào)
整和優(yōu)化，并歡迎客戶和我們探討。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑B Tween 20 5 mL
試劑C 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑D （*分裝）已稀釋的即用型t-PA 一抗
試劑E （*分裝）*化羊抗兔IgG 1 支
（濃度1.5 mg/mL，稀釋比為1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液20ml
試劑F HRP-SA 復合物1 支（濃度1 μM，稀釋比1:50~1:200）100 μL
試劑G DAB 顯色液
試劑F 緩沖甘油封固劑10 mL
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲烷1.21g
氯化鈉7.6g
加蒸餾水800mL，濃鹽酸調(diào)pH 值至7.2~7.4，zui后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復液）
10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水900mL，濃鹽酸調(diào)pH 值至6.0，zui后定容至1000mL
或：0.5M EDTA 修復液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水700mL，用10mM NaOH 調(diào)pH 值至8.0，zui后定容至1000Ml
石蠟包埋組織切片免疫染色
實驗步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、
Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2 次（每
次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O 洗
2×2min；
4.抗原修復： 根據(jù)抗體說明書*方法進行抗原修復，常采用高壓、
微波（溫度達到98~100℃）或酶消化修復法，室溫自然冷卻，自來
水沖洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復方法見
附1）* 注：有些抗原勿需修復，直接進入第5 步封閉。
5.封閉： 滴加試劑C，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑D（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃
；
7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑C，37℃濕盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的*化二抗（試劑E），37℃
濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑C，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用試劑D 稀釋的試劑F（1：50~200，終濃度
5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應用DAB 溶液（試劑G）顯色；
15.復染：自來水充分沖洗，復染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標本干后，用試劑F 封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項：
1. 修復后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷
有可能導致結(jié)晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液
不能反復使用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶
液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS 充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween
20，否則會影響結(jié)果觀察。
5. 如須復染細胞核，則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封
片劑進行封片。
附1：抗原修復方法
常用抗原修復液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修復液
（pH8.0 或9.0）等等。
一、酶消化修復法
切片脫蠟水化處理，TBS 沖洗，在組織上滴加*或*，
37℃孵育20~30min 后TBS 沖洗即可。
二、微波抗原修復法
微波盒中加入抗原修復液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于
耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或繼續(xù)微波
10~15min，取出微波盒冷卻至室溫后，自來水沖洗，取出切片。因不
同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調(diào)整。
三、直接高壓抗原修復法
取修復液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片
架上，修復液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計時1.5~2.5min
即可脫離熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適
用于較難檢測或核抗原的修復。
四、隔水式高壓抗原修復法
不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修復液于微波爐
中加熱至沸騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上
鍋蓋，待噴氣后計時4~8 min 即可關閉熱源，自然冷卻至室溫后自來
水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。