產(chǎn)品品牌：Invitrogen
產(chǎn)品名稱：Lipofectamine™ 2000 轉(zhuǎn)染試劑
產(chǎn)品貨號：11668-019
產(chǎn)品規(guī)格：1.5ml
產(chǎn)品描述：Lipofectamine™ 2000轉(zhuǎn)染試劑是一種陽離子脂質(zhì)體,在體外可以轉(zhuǎn)染許多種哺乳動物細(xì)胞，對各類細(xì)胞系都可提供zui高的轉(zhuǎn)染效率，具有高效性和操作步驟簡單的優(yōu)點(diǎn)。脂質(zhì)體2000其轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞活性取決于許多實(shí)驗(yàn)因素,如細(xì)胞密度、脂質(zhì)體

 Lipofectamine™ 2000 轉(zhuǎn)染試劑是一種陽離子脂質(zhì)體,在體外可以轉(zhuǎn)染許多種哺乳動物細(xì)胞，對各類細(xì)胞系都可提供zui高的轉(zhuǎn)染效率，具有高效性和操作步驟簡單的優(yōu)點(diǎn)。脂質(zhì)體2000其轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞活性取決于許多實(shí)驗(yàn)因素,如細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA的濃度、脂質(zhì)體2DNA復(fù)合物的作用時間以及是否有其它介質(zhì)成分如抗生素和血清。

使用Lipofectamine™ 2000試劑，您可以獲得：
*在多種細(xì)胞系中具有*地轉(zhuǎn)染效率和較高水平地重組蛋白表達(dá)
*傳輸siRNA的優(yōu)異性能
*在有血清存在的情況下可保證轉(zhuǎn)染效力——轉(zhuǎn)染后無需更換培養(yǎng)基
*保證可以用于高通量應(yīng)用的試劑
*用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的可靠試劑Lipofectamine™ 2000試劑為大多數(shù)細(xì)胞提供了zui高的轉(zhuǎn)染效率和活性。當(dāng)存在血清或用于進(jìn)行蛋白表達(dá)的細(xì)胞系（如COS-7，CHO和293）時，Lipofectamine™ 2000尤為有效，效率可超過90%。

Lipofectamine™ 2000 轉(zhuǎn)染試劑操作流程     
事實(shí)上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡單：稀釋DNA以及Lipofectamine 2000，混合2種稀釋液保溫20分鐘，加入培養(yǎng)細(xì)胞中孵育24－96小時檢測結(jié)果。下面是Invitrogen提供的詳細(xì)流程和注意事項(xiàng)。
1、轉(zhuǎn)染前一天，*消化細(xì)胞并計數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細(xì)胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。
2、對于每孔細(xì)胞，使用50μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋0.8μg-1.0μg DNA。
3、對于每孔細(xì)胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE2000試劑。Lipofectamine 2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性。） 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋，細(xì)胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為Lipofectamine 2000的稀釋液，必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。
4、混合稀釋的DNA（第2步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第3步）。在室溫保溫20分鐘。 注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可以在室溫保持6小時穩(wěn)定。
5、直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。注意：如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為0.5ml無血清培養(yǎng)基。
6、在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。
7、在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動子活性。對穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。
8、對于96孔板培養(yǎng)，不再需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，而可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將細(xì)胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了，這樣進(jìn)一步減少了轉(zhuǎn)染時間。這種改進(jìn)步驟已經(jīng)過293-H，293-F，COS-7L和CHO細(xì)胞的試驗(yàn)，同傳統(tǒng)方法相比活性稍低?？旖莸牟襟E和蛋白表達(dá)細(xì)胞系的高效轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染，比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時表達(dá)。

脂質(zhì)體2000適用細(xì)胞株范圍
不同的轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株范圍各不相同。一個實(shí)驗(yàn)室常常會用到不止一種細(xì)胞株，甚至是比較特殊的細(xì)胞株。一個轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株越多，當(dāng)然越受用戶的歡迎。根據(jù)Invotrogen的資料，Lipofectamine2000已經(jīng)證實(shí)可用于高達(dá)517種細(xì)胞株，覆蓋了相當(dāng)廣的范圍。

適用的核酸類型和DNA大小
有的轉(zhuǎn)染試劑是為siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計的，有的則是為DNA轉(zhuǎn)染設(shè)計。Lipofectamine 2000可以適用于包括DNA，siRNA,dsRNA, 熒光標(biāo)記的Oligo, RNA等在內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)染，這使得Lipofectamine2000適用范圍非常廣泛，無論是基因表達(dá)分析的DNA轉(zhuǎn)染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能勝任，不需要為不同目的購買不同試劑了。但，zui常用的DNA轉(zhuǎn)染中有一個DNA大小的問題，太大的質(zhì)粒不那么好轉(zhuǎn)。

脂質(zhì)體2000用量
Lipofectamine 2000用的劑量根據(jù)說明書，24孔板轉(zhuǎn)染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000大約可做750次24孔板轉(zhuǎn)染，或者大約150次6孔板轉(zhuǎn)染。

注意事項(xiàng)     
Lipofectamine2000要求細(xì)胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響。Lipofectamine 2000可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基，使得操作方便了許多，但是要注意制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時要求用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，因?yàn)檠鍟绊憦?fù)合物的形成。
 
復(fù)合物形成后是可以加入血清。這里要特別注意檢測所用的無血清培養(yǎng)基是否能和Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFMII,VP-SFM就不行。此外還應(yīng)該留意，如果研究的基因要求比較長的表達(dá)時間，比如細(xì)胞周期相關(guān)基因，或者時細(xì)胞表面蛋白，選擇細(xì)胞鋪板密較低的轉(zhuǎn)染試劑，不適合用Lipofectamine 2000。

對于大多數(shù)陽離子脂質(zhì)體試劑，應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和陽離子脂質(zhì)體試劑量以得到zui大的轉(zhuǎn)染效率。DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例，通常*是1:2或者1:3，優(yōu)化可以從0.5-5之間慢慢試。使用小劑量確定的優(yōu)化條件可以用于進(jìn)行大劑量的轉(zhuǎn)染，只要根據(jù)培養(yǎng)板表面比例線性增加鋪板細(xì)胞的數(shù)目、陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA量就可以了。
 
還有轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素?？股兀热?和*，一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前就不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用*和*，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。
 
陽離子脂質(zhì)體應(yīng)該在4度保存，要注意避免多次反復(fù)長時間開蓋，因?yàn)榭赡軙?dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)然還有要注意質(zhì)粒的質(zhì)量，質(zhì)粒的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵。