臨床基因擴(kuò)增（PCR）實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)
概述 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱PCR實(shí)驗(yàn)，是專門用來檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測(cè)出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測(cè)方法可以測(cè)出普通檢驗(yàn)難以檢測(cè)出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對(duì)樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測(cè)部門的禽疫病診斷。但是，這種實(shí)驗(yàn)需要有能保證安全、配置合理的實(shí)驗(yàn)室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí).....
1 概述
臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱PCR實(shí)驗(yàn)，是專門用來檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測(cè)出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測(cè)方法可以測(cè)出普通檢驗(yàn)難以檢測(cè)出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對(duì)樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測(cè)部門的禽疫病診斷。但是，這種實(shí)驗(yàn)需要有能保證安全、配置合理的實(shí)驗(yàn)室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)越來越得到重視，因?yàn)樗鼘?duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本文主要從臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的平面布局，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制和污染的防制幾個(gè)方面對(duì)
實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中的主要特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。因此，實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞這個(gè)核心問題進(jìn)行的。下面就對(duì)這幾個(gè)方面分別進(jìn)說明。
2 PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。
各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。
PCR實(shí)驗(yàn)室平面布置示意圖如圖1所示。
圖1 某食品藥品檢驗(yàn)所PCR實(shí)驗(yàn)室平面布置示意圖
3 實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制
PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。
3.1 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
對(duì)與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。
3.2 標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。
本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。
3.3 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。
本區(qū)是主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。
4 污染的預(yù)防與控制
PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。
4.1 工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分
（1）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；
（2）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。
4.2 合理的系統(tǒng)設(shè)置
（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；
（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。
4.3 規(guī)范的操作
（1）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作；
（2）在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；
（3）清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對(duì)一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。
4.4 嚴(yán)格的管理
（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；
（2）在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服（如不同顏色），當(dāng)工作人員離開時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；
（3）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。
（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；
（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。
4.5 完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施
完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。
