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奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊

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奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊在生命科學(xué)領(lǐng)域,隨著科研水平和實驗手段不斷的提高,熒光染色方法以其特異性強,使用相對于放射性元素更安全,檢測越來越靈敏等特點,受到越來越多的研究人員的認可,并且在實驗室中廣泛應(yīng)用,成為經(jīng)常性的實驗方法

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奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊

在生命科學(xué)領(lǐng)域,隨著科研水平和實驗手段不斷的提高,熒光染色方法以其特異性強,使用相對于放射性元素更安全,檢測越來越靈敏等特點,受到越來越多的研究人員的認可,并且在實驗室中廣泛應(yīng)用,成為經(jīng)常性的實驗方法。
檢測熒光方法和手段根據(jù)不同的實驗要求和目的也多種多樣,使用最多的還是熒光顯微鏡,熒光酶標(biāo)儀,流式細胞儀等。但是,無論何種儀器,無論儀器的性能如何,要得到準(zhǔn)確的實驗結(jié)果,準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù),最基本的條件就是根據(jù)所使用的熒光染料正確設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長。
奧林巴斯
顯微鏡熒光激發(fā)塊

下面我們以熒光顯微鏡的熒光濾色鏡為例,介紹一下濾色鏡組的構(gòu)造以及根據(jù)染料,如何正確選擇濾色片。
熒光激發(fā)塊是熒光顯微鏡中用來激發(fā)熒光標(biāo)本和觀察熒光的核心部件,它實際是濾色片的組合,一般含有3種濾色片:
1. 激發(fā)濾色片(Exciter Filter):選擇透過某個波段的光,來激發(fā)熒光染料。
2. 分色鏡 (Dichroic Mirror):反射激發(fā)光,透過熒光,一般激發(fā)光波長短,而發(fā)射光波長較長。
3. 發(fā)射濾色片(Barrier Filter) :透過發(fā)射光,也就是我們看到的“熒光”。同時阻擋各種雜散光和激發(fā)光的反射光。

奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊

根據(jù)熒光觀察的原理—熒光染料吸收特定波長的光(即激發(fā)光),躍遷到激發(fā)態(tài),然后再釋放出特定波長的發(fā)射光(即熒光),回到基態(tài)。由此可知熒光染料所需的激發(fā)光和釋放的熒光都是特定波長的,所以需要利用各種濾色片來選擇性的透過某種特定波長的光來實現(xiàn)熒光觀察。否則,就會出現(xiàn)激發(fā)不了,激發(fā)了卻看不到或串色的現(xiàn)象。所以選擇合適的濾色片非常重要!
下面我們以熒光染料DAPI為例,闡述該如何選擇熒光激發(fā)塊。

通過上圖,我們可以了解到DAPI的激發(fā)光波長為300nm-410nm左右,激發(fā)峰值在360nm左右,也就是說激發(fā)光在300-410nm時可以激發(fā)DAPI染料,在360nm時激發(fā)高。發(fā)射光波長為390nm-600nm,峰值在470nm左右。接著,我們就根據(jù)這些數(shù)據(jù)來選擇濾色片。

上圖為Olympus U-FUW激發(fā)塊的光譜信息。我們可以了解到此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光波長在300-400nm之間,剛好可以激發(fā)DAPI。允許透過的熒光光譜范圍也在410nm以上,所以此激發(fā)塊可以用來實現(xiàn)DAPI熒光染料的觀察。
讓我們再來看一個激發(fā)塊的光譜圖:

上圖為olympus U-FGW激發(fā)塊的光譜信息,可以看出此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光在530-560nm左右,允許透過的熒光光譜范圍在570nm以上,所以此激發(fā)塊并不適合DAPI激發(fā)。如果用此激發(fā)塊來做DAPI的觀察,就會出現(xiàn)看不到熒光的現(xiàn)象。
可見,要選擇合適的熒光激發(fā)塊,我們首先要知道熒光染料激發(fā)和發(fā)射光的波長特性和激發(fā)塊光譜的各項數(shù)據(jù)。但是,熒光染料和濾色片的種類非常多,用戶往往沒有渠道來獲取這些信息。在實際實驗中使用熒光顯微鏡時,因為熒光激發(fā)塊配置錯誤而得不到好的觀察效果的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生,對于用戶來說是一件非常煩惱的事。
為了方便用戶正確選擇激發(fā)和發(fā)射波長,節(jié)省時間,日本理化研究所腦科學(xué)所-奧林巴斯合作中心開發(fā)了軟件Spectrum Manager。用戶選擇熒光染料,軟件會給出染料的光譜信息和推薦的濾色片選擇等信息,使用非常方便。

還可利用Data Manager自行對光源信息、染料數(shù)據(jù)庫或濾色片信息進行更新。

奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊

此款軟件已經(jīng)整合至奧林巴斯共聚焦顯微鏡的一款軟件中,發(fā)布以來得到了用戶非常好的反響。由于是針對共聚焦顯微鏡的軟件,所以軟件中僅提供了激光光源譜線。如果您有需要,也可以將汞燈和氙燈光源信息導(dǎo)入至軟件。
以下提供普通熒光顯微鏡常用的汞燈和氙燈光源的圖譜,供大家參考。

汞燈在313, 334, 365, 406, 435, 546, 578nm有比較好的激發(fā)峰。

氙燈在可見光光譜范圍內(nèi)強度更穩(wěn)定(沒有像汞燈那樣的光譜峰值),在紅外波段比汞燈強度高。但在紫外波段有一定的缺陷性。
所以選擇光源時,光源特性一定要與我們的具體應(yīng)用相匹配。


奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊規(guī)格

名稱 激發(fā)光波長(顏色) 發(fā)射光波長(顏色) 二次分光波長(顏色) 帶寬 通道類型
U-MWU2 330-385不可見 420藍色 400紫色
U-MNU2 360-370不可見 420藍色 400紫色
U-MNV2 400-410紫藍色 455藍色 455藍色
U-MWBV2 400-440藍紫色 475藍色 455藍色
U-MNBV2 420-440藍色 475藍色 455藍色
U-MWB2 460-490藍色 520IF綠色 500綠色
U-MNB2 470-490藍色 520IF綠色 500綠色
U-MSWB2 420-440藍色 475藍色 455藍色 超寬
U-MWIB2 460-490藍綠色 510IF綠色 505綠色
U-MWG2 510-550綠色 590綠色 570綠色
U-MNG2 530-550綠色 590綠色 570綠色
U-MSWG2 480-550綠色 590綠色 570綠色 超寬
U-MWIG2 520-550綠色 580IF綠色 565綠色
U-MWIY2 545-580綠色 610IF紅色 600紅色
U-MNUA2 360-370不可見 420-460藍色 400紫色
U-MWIBA2 460-490藍色 510-550綠色 505綠色
U-MNIBA2 470-490藍色 510-550綠色 505綠色
U-MGFPHQ 460-480HQ藍色 495-540HQ綠色 485藍色  
U-MYFPHQ 490-500HQ藍綠色 515-560HQ綠色 505綠色  
U-MCFPHQ 425-445HQ藍色 460-510HQ藍綠色 450藍色  













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