目前，微型模式動(dòng)物、模式植物種子、大體積細(xì)胞及微球的分選在生命科學(xué)研究中有著非常廣泛的應(yīng)用，但是由于這些研究對(duì)象體積太大，普通流式細(xì)胞儀難以對(duì)其進(jìn)行分選，而人工手動(dòng)在顯微鏡鏡下分選耗時(shí)耗力、效率低下、準(zhǔn)確性難以保證，因此一種自動(dòng)化大體積微粒分選系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，它就是COPAS蠕蟲/胚胎流式分選系統(tǒng)/多參數(shù)生物微粒分析與分選系統(tǒng)。
COPAS大顆粒流式分選系統(tǒng)可以檢測(cè)微粒的尺寸、光密度及熒光信號(hào)，并根據(jù)用戶設(shè)定的域值，將相應(yīng)的微粒移入96孔板或其它容器中，*的技術(shù)使得整個(gè)過(guò)程對(duì)于微粒的生物活性不會(huì)產(chǎn)生任何負(fù)面影響。
COPAS系統(tǒng)基于流式細(xì)胞技術(shù)的深度開發(fā)，與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀相比，有兩個(gè)重要改進(jìn)：
*，系統(tǒng)管路直徑增大，以適應(yīng)20-1500um大小的生物微粒分選；
第二，采用的氣流動(dòng)態(tài)分選技術(shù)，保證收集到的生物活體的活性和完整性；
與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀相比：
| 傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀 | COPAS* |
分選/分選參數(shù) | 前向角（FSC） | TOF（Time Of Flight）飛行時(shí)間 |
側(cè)向角（SSC） | EXT (Extinction) |
熒光參數(shù) | 熒光參數(shù) |
分選樣本大小 | 1-100um | 20-1500um |
分選方式 | 電磁場(chǎng) | 空氣動(dòng)力 |
分選壓力 | 12 – 60 PSI | 2 – 5 PSI |
產(chǎn)品特點(diǎn)：
l **能夠分選10-1500um生物微粒的自動(dòng)化高通量分選系統(tǒng)
l 模式動(dòng)物、模式植物種子與花粉、大體積細(xì)胞與細(xì)胞簇、微球/顆粒、高通量藥物分選
l 同時(shí)檢測(cè)微粒的五種光學(xué)參數(shù)：微粒的尺寸、光密度及三色熒光信號(hào)
l 氣動(dòng)分選技術(shù)，保證收集到的生物活體或敏感化學(xué)物質(zhì)的活性和完整性，整個(gè)過(guò)程對(duì)微粒的生物活性不會(huì)產(chǎn)生任何負(fù)面影響
l 篩選速度達(dá)到每小時(shí)100,000個(gè)化合物，同時(shí)大大節(jié)省樣品的消耗量
l 全自動(dòng)、高通量、高精度篩選，適用于大規(guī)模篩選
應(yīng)用領(lǐng)域：
COPAS大顆粒流式分選系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用在模式動(dòng)植物研究、大體積細(xì)胞研究及藥物篩選等方面，具體應(yīng)用對(duì)像包括微型模式動(dòng)物:C .elegans、D .melanogaster、Zebrafish、Medaka, Mosquito, Xenopus;模式植物種子與花粉:Arabidopsis、花粉;大體積細(xì)胞與細(xì)胞簇:胚胎干細(xì)胞、胰島;微球/顆粒:化合物結(jié)合微球、微球分析。
1.蠕蟲發(fā)育表達(dá)譜
對(duì)單一基因來(lái)說(shuō)，其在發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的變化可依據(jù)其表達(dá)量來(lái)說(shuō)明，什么時(shí)候表達(dá)開始或者減弱。如右圖所示，不同基因在不同發(fā)育階段表達(dá)量的變化：從幼蟲到成蟲，咽部基因的表達(dá)量一直在增加，會(huì)陰部基因只有蠕蟲發(fā)育成熟才開始表達(dá)；肛門肌肉基因的微弱表達(dá)也可用該方法檢測(cè)到。更多分析請(qǐng)參考：DuPuy, et al., Nature Biotechnology, 25, 663-338, 7 May 2007。
2.繪制斑馬魚側(cè)面熒光圖
基于參數(shù)峰值數(shù)量（Number of Peaks for each Parameter）進(jìn)行分選。如下圖，一條四日齡、野生型斑馬魚軸向側(cè)面圖（被標(biāo)記紅色熒光）。
3.在水凝珠內(nèi)部生長(zhǎng)的細(xì)胞簇
在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，水凝珠作為細(xì)胞生長(zhǎng)的基質(zhì)，將細(xì)胞包裹在內(nèi)。COPAS以Peak Width作為細(xì)胞生長(zhǎng)程度的依據(jù)，分選出只含有單個(gè)細(xì)胞的水凝珠，進(jìn)而得到來(lái)源單一的細(xì)胞簇。(Courtesy of S.Panke and M.Walser, ETH, Zurich.)
4.大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分選
利用PI染料標(biāo)記，分選大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，如右圖：
5.在藥物篩選方面的新應(yīng)用
(1)結(jié)合分析，動(dòng)力學(xué)與竟?fàn)幏治?/span>(BindingAssays, kinetics and competition assays)
使用COPAS生物分選系統(tǒng)在以微球?yàn)檩d體的化合物庫(kù)中篩選能與帶有熒光標(biāo)記的目標(biāo)蛋白結(jié)合的化合物，將陽(yáng)性化合物微球加人微孔板以進(jìn)行后續(xù)的MS,NMR及其它分析，將沒(méi)有結(jié)合蛋白的陰性化合物微球加人收集容器以便重復(fù)使用。另外，還可以根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱設(shè)定域值，將陽(yáng)性化合物微球進(jìn)一步分為結(jié)合能力不同的幾群。目前，已經(jīng)有科學(xué)家利用這種技術(shù)找到了一個(gè)能與纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子粘多糖結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的硫酸鹽化合物。
(2) On-bead酶一底物篩選(On-bead enzymesubstrate discovery)
將需要研究的多肽，如點(diǎn)突變多肽，兩端標(biāo)記上淬滅熒光基團(tuán)(FRAP )，然后連接到微球上，從而建立一個(gè)以微球?yàn)檩d體的多肽庫(kù)。將多肽微球與目的蛋白酶結(jié)合，如果蛋白酶能夠切斷多肽，就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。由于使用COPAS高速分選技術(shù)，陽(yáng)性微球可以被快速分選，以保證微球表面仍有足夠多的完整多肽以便進(jìn)行后續(xù)分析。從建立多肽庫(kù)到陽(yáng)性多肽序列分析的整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，可以在一周內(nèi)完成，與傳統(tǒng)方法相比效率提高了一百倍。丹麥的一個(gè)研究小組已經(jīng)利用該技術(shù)研究了枯草桿菌蛋白酶的多肽底物結(jié)構(gòu)。
(3)蛋白酶抑制劑篩選
COPAS技術(shù)的一個(gè)更為復(fù)雜的應(yīng)用是在蛋白酶抑制劑篩選方面。首先，將帶有淬滅熒光基團(tuán)(FRAP )的蛋白酶底物多膚連接在微球的一部分結(jié)合位點(diǎn)上，然后將需要篩選的抑制劑連接在微球的其它結(jié)合位點(diǎn)上，從而建立一個(gè)以微球?yàn)檩d體的抑制劑庫(kù)。將微球與蛋白酶一起孵育，如果抑制劑無(wú)效，蛋白酶會(huì)將多肽切斷，微球產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)。如果抑制劑效果很強(qiáng)，蛋白酶無(wú)法切斷多肽，微球沒(méi)有熒光信號(hào)。如果抑制劑無(wú)法*抑制蛋白酶活性，那么仍會(huì)有部分多肽被切斷，微球會(huì)發(fā)出較弱的熒光信號(hào)。這樣就可以利用COPAS技術(shù)根據(jù)微球熒光信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)微球進(jìn)行分選，從而快速找到不同抑制強(qiáng)度的抑制劑。這種技術(shù)在篩選抑制劑和優(yōu)化反應(yīng)條件方面具有很高的效率和很大的靈活性，可以實(shí)現(xiàn)每小時(shí)100000個(gè)化合物的高速篩選。利用這種技術(shù)，荷蘭的一個(gè)研究小組在數(shù)周內(nèi)找到了*和多種基質(zhì)金屬蛋白酶的多種抑制劑。
綜上所述，COPAS大顆粒流式分選系統(tǒng)在大微粒分選方面的強(qiáng)大功能，必將為人類健康作出貢獻(xiàn)。
*，系統(tǒng)管路直徑增大以適應(yīng)10-1500um大小的生物微粒，這比普通流式細(xì)胞儀用于分選單個(gè)真核細(xì)胞的管路大的多。每一個(gè)COPAS大顆粒流式分選系統(tǒng)都針對(duì)不同尺寸范圍的微粒進(jìn)行管路的優(yōu)化設(shè)計(jì)，以便在高速高通量分選時(shí)獲得的檢測(cè)靈敏度與準(zhǔn)確性。
第二，COPAS大顆粒流式分選系統(tǒng)技術(shù)的核心，即的氣流分選裝置(圖1、表1)。當(dāng)不需要收集時(shí)，分選系統(tǒng)會(huì)通過(guò)氣體將液流吹人廢液槽中;當(dāng)需要分選的微粒經(jīng)過(guò)時(shí)，分選系統(tǒng)會(huì)暫時(shí)將氣體分流器關(guān)閉，使氣流中斷，然后再重新打開分流器，這樣就能將含有待選微粒的液流噴人微孔板或收集容器中。這種分選的方式非常溫和，可以保證收集到的生物活體或敏感化學(xué)物質(zhì)的活性和完整性，對(duì)于后續(xù)的培養(yǎng)和分析不會(huì)產(chǎn)生任何負(fù)面影響，而普通流式細(xì)胞儀一般采用電磁場(chǎng)進(jìn)行分選，會(huì)對(duì)生物活體產(chǎn)生致命的影響。
COPAS大顆粒流式分選系統(tǒng)可以同時(shí)檢測(cè)微粒的五種光學(xué)參數(shù)，包括微粒的光密度(Extinction,EXT)、微粒的軸向長(zhǎng)度(Time Of Flight,TOF )，以及三色熒光信號(hào)(表1)。樣本懸液在鞘液的包裹下形成層流，生物微粒被聚焦在液流的中心輸送到流動(dòng)室，通過(guò)兩個(gè)低能激光器來(lái)激發(fā)和檢測(cè)光信號(hào)。其中，一個(gè)紅色激光器( 670nm)被用來(lái)檢測(cè)微粒的軸向長(zhǎng)度和光密度，而另一個(gè)多色氫激光器(488/514nm)被用來(lái)激發(fā)多種熒光素。儀器的標(biāo)準(zhǔn)配置包括綠光、黃光及紅光檢測(cè)器，用來(lái)檢測(cè)受激發(fā)的熒光素發(fā)出的光信號(hào)。這些實(shí)時(shí)檢測(cè)的參數(shù)被用來(lái)將樣本中的微粒分群，只有那些符合用戶設(shè)定域值的微粒才會(huì)被分選系統(tǒng)加人微孔板或樣品收集容器中，而那些不在用戶設(shè)定域值范圍內(nèi)的微粒也可以被收集起來(lái)，以備后續(xù)的其它操作。zui終的分選速度取決于樣本的濃度和需要分選的微粒所占的百分比，zui快可以達(dá)到每小時(shí)100, 000個(gè)微粒。
