5. 操作方法
5.1. 樣品制備:
(1) 固體樣品:如果樣品粒度>0.5mm,研磨后過0.3-0.5mm(40-60目)篩。
(2) 高脂肪樣品:如果脂肪含量>10%,用石油醚去脂。每克樣品用25ml,每次提取完靜置一會兒再小心將燒杯傾斜,慢慢將石油醚倒出,共洗三次。
(3) 高碳水化合物樣品:如果樣品干重含糖>50%,用85%乙醇去除糖份,每克樣品每次10ml,共洗三次輕輕倒出,然后在40℃烘箱中不時翻攪干燥過夜,并研磨過0.5mm篩。
5.2. 樣品消化
(1) 準(zhǔn)確稱取雙份1.000±0.005g樣品(M1和M2),置于高腳燒杯中。
(2) 在每個燒杯中加入40ml MES-TRIS緩沖液,在磁力攪拌器上攪拌直到樣品*分散。(防止團(tuán)塊形成,使受試物與酶能充分接觸)。
(3) 用熱穩(wěn)定的*進(jìn)行酶解處理:加100μl熱穩(wěn)定的*溶液,低速攪拌。用鋁箔片將燒杯蓋住,在95-100℃水浴中反應(yīng)30分鐘。( 起始的水浴溫度應(yīng)達(dá)到95℃)。
(4) 冷卻:所有燒杯從水浴中移出,涼至60℃。打開鋁箔蓋,用刮勺將燒杯邊緣的網(wǎng)狀物以及燒杯底部的膠狀物刮離,以使樣品能夠*的酶解。用10ml蒸餾水沖洗燒杯壁和刮勺。
(5) 用蛋白酶進(jìn)行酶解處理:在每個燒杯中各加入100μl蛋白酶溶液。用鋁箔蓋住,在60℃持續(xù)搖動反應(yīng)30分鐘(開始時的水浴溫度應(yīng)達(dá)60℃),使之充分反應(yīng)。
(6) pH值測定:30分鐘后,打開鋁箔蓋,攪拌中加入5ml0.561mol/L HCL至燒杯中。60℃時用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCL溶液調(diào)zui終pH為4.0-4.7。(注意:當(dāng)溶液為60℃時檢測和調(diào)整pH,因為在較低溫度時pH會偏高。)
(7) 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解處理:攪拌同時加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。用鋁箔蓋住,在60℃持續(xù)振搖反應(yīng)30分鐘,溫度應(yīng)恒定在60℃。
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