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淀粉蛋白腦室內(nèi)注射建立阿爾茨海默病大鼠模型
【摘要】 目的 觀察β淀粉樣蛋白（Aβ） 腦室內(nèi)注射建立阿爾茨海默病（AD） 大鼠模型及其對(duì)大鼠行為、*乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF） 水平等影響。方法 將Aβ1242 注射入大鼠側(cè)腦室,于第1 周、2 周、4 周觀察Morris 水迷宮逃避潛伏期、測(cè)定腦內(nèi)ChAT 活性、進(jìn)行原位末端標(biāo)記凋亡染色及NGF 免疫組化染色。結(jié)果 Aβ1242 注射后第2 周大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期延長(zhǎng),4 周時(shí)更明顯。2 周后海馬、皮層ChAT 活性下降,4 周后腦內(nèi)ChAT 活性廣泛下降,以海馬zui為顯著。2 周后基底前腦Meynert核區(qū)凋亡細(xì)胞較其他腦區(qū)增多,NGF 陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。結(jié)論 Aβ腦室內(nèi)注射可以模擬AD 行為改變,使腦內(nèi)ChAT 活性降低,基底前腦NGF 含量減少,*能神經(jīng)元凋亡,可以作為AD 研究模型。
【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 *乙酰轉(zhuǎn)移酶 神經(jīng)生長(zhǎng)因子
【中圖分類號(hào)】 R749. 1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A
阿爾茨海默病（Alzheimer Disease , AD） 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是β淀粉樣蛋白（β2amyloid protein ,Aβ） 在腦中的沉積[1 ] ,多種神經(jīng)元尤其是*能神經(jīng)元原發(fā)性變性,腦內(nèi)*乙酰轉(zhuǎn)移酶（cholineacetyl transferase ,ChAT） 活性下降,是AD 的標(biāo)志性生化改變[2 ] 。AD 等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[3 ] ,而神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor ,NGF） 是中樞*能系統(tǒng)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,具有明顯的抗凋亡作用[4 ] 。
AD 基礎(chǔ)研究和藥物開(kāi)發(fā)的zui大障礙是缺乏一種與AD 病理、生化、和行為等改變相似的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Aβ腦室內(nèi)注射建立AD 大鼠模型,觀察大鼠行為學(xué)改變、腦內(nèi)各部位ChAT 活性變化、神經(jīng)元凋亡情況,以及NGF 水平改變,為進(jìn)一步的AD 治療研究提供動(dòng)物模型。
1 材料與方法
111 動(dòng)物分組及Aβ腦室內(nèi)注射 雄性Wistar 大鼠48 只,體重260～300 g ,隨機(jī)分為4 組:對(duì)照組、Αβ注射后7 天組、14 天組、28 天組,每組12 只。大鼠麻醉后用微量注射器緩慢將藥物注入右側(cè)腦室（前囪后018 mm ,中線旁開(kāi)111 mm ,深度316 mm） 。Aβ模型組注射Aβ1242 （購(gòu)自美國(guó)AnaSpec 公司） ,每次7 μg ,連續(xù)3天,對(duì)照組注射生理鹽水,每次7μL ,連續(xù)3 天。
112 Morris 水迷宮試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[5 ] ,記錄大鼠找到平臺(tái)所需逃避潛伏期。各實(shí)驗(yàn)組分別于zui后1 次藥物注射后第5～7d ,12～14 d ,26～28 d 進(jìn)行試驗(yàn),對(duì)照組同時(shí)試驗(yàn)。
113 取材 Aβ注射組分別于zui后1 次藥物注射后第7 天、14天、28 天宰殺取材,對(duì)照組于zui后1 次藥物注射后28 天取材。每組取6 只快速斷頭取腦,立即凍于液氮中,待測(cè)ChAT 活性。另6 只4 %多聚甲醛透心灌注后于4 %多聚*中固定72小時(shí)以上,進(jìn)行TUNEL 凋亡染色及NGF 免疫組化染色。
114 ChAT活性檢測(cè)及定量分析 液氮中凍存腦組織分別取海馬、基底節(jié)、額葉、頂葉皮層制備5 %（V/ W） 腦組織勻漿, 按照Fonnum[6 ]的放免方法,在70μL 總反應(yīng)體積中,含試樣液或空白對(duì)照液20μL ,1114 g/ L 乙酰輔酶A（Sigma 公司） 10μL ,70 mmol/L *（Sigma 公司） 8μL ,1 mmol/ L 溴化新斯的明（Sigma 公司） 7μL ,3 mmol/ L 氯化鈉7μL ,317 ×104 Bq/ mL 14C2乙酰輔酶A 10μL ,在液體閃爍儀上測(cè)定每分鐘衰變數(shù)（cpm） 。以對(duì)照組各部位衰變數(shù)為100 % ,計(jì)算各組各部位ChAT 相對(duì)活性。
115 TUNEL 凋亡染色及半定量分析 選取基底節(jié)、海馬、額葉、頂葉同時(shí)存在矢狀斷面切片,按TUNEL 凋亡染色試劑盒（武漢博士德公司） 說(shuō)明書操作,進(jìn)行TUNEL 細(xì)胞凋亡染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一切片高倍視野（400 ×） 下每部位取4 個(gè)視野共計(jì)數(shù)100 個(gè)神經(jīng)元,計(jì)算凋亡神經(jīng)元陽(yáng)性百分率,即神經(jīng)元凋亡指數(shù)（NAI） 。
116 NGF 免疫組化染色及圖像分析 取上述石蠟切片,按NGF免疫組化試劑盒（武漢博士德公司） 說(shuō)明書操作染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一染色片高倍視野（400 ×） 下取5 個(gè)視野,用美國(guó)UIC 公司Metamorph Image System V416 圖像分析軟件得出陽(yáng)性染色細(xì)胞平均灰度值（Average gray value Average） 。
117 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ±s） 表示,各組間ChAT 活性、水迷宮試驗(yàn)潛伏期、NGF 陽(yáng)性神經(jīng)元平均灰度值比較采用t 檢驗(yàn),神經(jīng)元凋亡指數(shù)組間比較采用χ2 檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
211 Morris 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果 各組逃避潛伏期分別為:對(duì)照組（1211 ±514） s ;Aβ注射后7 天組為（1411 ±519） s ,Aβ注射后14天組為（2116 ±617） s ,Aβ注射后28 天組為（4510 ±1013） s。Aβ注射后7 天潛伏期與對(duì)照組比較無(wú)變化,注射后14 天潛伏期延長(zhǎng)（ P < 0105） ,注射后28 天潛伏期明顯延長(zhǎng)（ P < 0101） ,提示大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損。
212 Aβ腦室注射對(duì)ChAT 活性影響 Aβ腦室內(nèi)注射對(duì)腦內(nèi)ChAT 活性影響見(jiàn)表1 。
表1 Aβ對(duì)ChAT活性（ cpm） 影響
組 別 額葉基底節(jié)海馬頂葉
對(duì) 照 組1208. 5 ±49. 8 3662. 3 ±118. 5 2584. 0 ±98. 8 1184. 2 ±53. 2
Aβ注射后7 天1183. 8 ±26. 7 3559. 7 ±120. 3 2513. 0 ±99. 8 1139. 3 ±43. 6
Aβ注射后14 天1033. 4 ±47. 92）3507. 5 ±126. 6 2234. 2 ±84. 52） 1088. 3 ±63. 01）
AB 注射后28 天950. 1 ±67. 52）3228. 5 ±153.
02） 1833. 0 ±57. 62） 941. 8 ±42. 42）
1） 與對(duì)照組比較, P < 0. 05 2） 與對(duì)照組比較, P < 0. 01
腦室內(nèi)注射Aβ7 天后,各部位腦組織ChAT 活性無(wú)明顯下降,
14 天后海馬、額葉ChAT 活性明顯下降,28 天后各腦區(qū)ChAT 活性均明顯下降（ P < 0101） ,以海馬下降z(mì)ui明顯,降至對(duì)照組的71 %。
213 Aβ對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的影響 TUNEL 凋亡染色可見(jiàn)細(xì)胞核呈棕黃色染色的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞,對(duì)照組及注射后7 天各腦區(qū)見(jiàn)個(gè)別散在凋亡細(xì)胞,Aβ注射后14 天可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞,28 天后明顯增多,NAI 升高,基底前腦Meynert 核區(qū)達(dá)1917 % ,海馬、額葉、頂葉分別為617 % ,512 % ,413 % ,Meynert 核區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯多于海馬及皮層（ P < 0101） 。Meynet 核凋亡染色見(jiàn)圖1 。
214 Aβ對(duì)腦內(nèi)NGF 表達(dá)水平的影響 NGF 免疫組化染色于海馬、額葉、頂葉、基底前腦均可見(jiàn)胞質(zhì)黃褐色深染陽(yáng)性細(xì)胞,Aβ注射7 天后無(wú)明顯變化,14～28 天可見(jiàn)基底前腦區(qū)NGF 陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,染色變淺,其他腦區(qū)NGF 表達(dá)水平無(wú)明顯變化。基底前腦區(qū)NGF染色見(jiàn)圖2 。用美國(guó)UIC 公司Metamorph Image System V416 圖像分析軟件得出陽(yáng)性染色細(xì)胞平均灰度值（Average gray value） 。
表2 NGF 免疫組化染色細(xì)胞平均灰度值
組 別 額葉基底節(jié)海馬頂葉
對(duì) 照 組135. 48 ±17. 27 129. 67 ±18. 49 126. 87 ±9. 56 138. 46 ±13. 54
Aβ注射7 天后129. 32 ±14. 47 134. 57 ±10. 38 125. 48 ±8. 21 139. 76 ±9. 72
Aβ注射后14 天131. 21 ±17. 82 149. 65 ±9. 431） 129. 24 ±12. 59 128. 45 ±12. 43
Aβ注射后28 天126. 34 ±15. 97
175. 54 ± 12.
942） 116. 75 ±11. 16 128. 27 ±10. 03
1） 與對(duì)照組比較, P < 0105 2） 與對(duì)照組比較, P < 0101
3 討論
近十多年積累的資料表明,前腦基底核的*能神經(jīng)元、海馬和它們之間的通路,是學(xué)習(xí)記憶功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),損毀這些結(jié)構(gòu)或老齡化,可引起這些區(qū)域退化,導(dǎo)致智力嚴(yán)重缺損[7 ] 。ChAT 是ACh 的生物合成酶,存在于*能神經(jīng)元中,是衡量*能神經(jīng)元功能的標(biāo)志,也是AD 動(dòng)物模型成功的標(biāo)志性生化指標(biāo)[2 ,8 ] 。迄今為止,多數(shù)AD 物模型（如老年動(dòng)物代替模型、*能系統(tǒng)損毀模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型） 是在模仿AD 早期出現(xiàn)的記憶障礙或病理特征,使其應(yīng)用受到局限。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠急性腦室內(nèi)注射Aβ1242 ,4 周內(nèi)大鼠水迷宮試驗(yàn)表現(xiàn)逐漸下降,出現(xiàn)了AD 表現(xiàn),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9 ] 。腦內(nèi)海馬、基底節(jié),以及額葉、頂葉新皮層ChAT 活性均明顯下降,降至對(duì)照組水平70 %以下,說(shuō)明Aβ腦室內(nèi)注射對(duì)腦內(nèi)ChAT 活性的影響是廣泛和明顯的。Aβ沉積是AD 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和病理特征,本模型全面模擬了AD 病理、行為學(xué)和生化改變,因此腦室內(nèi)Aβ注射可以作為一種理想的AD 模型制作方法。ChAT 活性的下降實(shí)際上反映了*能神經(jīng)元功能的下降或變性,近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明,*能神經(jīng)元退化的主要方式也是細(xì)胞凋亡[3 ] 。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ChAT 活性降低的同時(shí),腦內(nèi)基底節(jié)、海馬等處的凋亡神經(jīng)元增多,并且以*能神經(jīng)元聚集的基底前腦區(qū)更為明顯,所以ChAT 活性的降低可能源于Aβ所致的*能神經(jīng)元凋亡?；浊澳X*能神經(jīng)元發(fā)出纖維投射到海馬、邊緣葉及大腦皮層,這些部位靶細(xì)胞中產(chǎn)生的NGF 通過(guò)*能神經(jīng)元的軸突末梢攝取后,經(jīng)軸漿逆向運(yùn)至其胞體所在的神經(jīng)節(jié),是基底前腦、隔區(qū)*能神經(jīng)元的主要營(yíng)養(yǎng)因子。Aβ腦室內(nèi)注射后2 周開(kāi)始,基底前腦神經(jīng)元NGF 含量減少,4 周時(shí)zui明顯,推測(cè)在本模型中,由于NGF 對(duì)基底前腦中樞*能神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)、支持作用減弱,導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡,引起AD 的一系列行為學(xué)、生化改變。如果能采用基因治療等方法及時(shí)補(bǔ)充基底前腦NGF ,將有可能治療AD 癥狀,延緩AD 的進(jìn)展,目前基因治療AD 是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),也是我們下一步的研究方向[10 ] 。綜上所述,Aβ腦室內(nèi)注射造成大鼠AD 樣行為學(xué)改變,腦內(nèi)ChAT 活性降低,基底前腦NGF 含量減少,*能神經(jīng)元凋亡,可以作為AD 研究的動(dòng)物模型。
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