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新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后的遠(yuǎn)期行為學(xué)測試
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[摘 要] 目的 目前對新生鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型的研究多采用病理學(xué)和生化指標(biāo),而缺乏功能評價(jià)手段。該研究對新生大鼠HIBD后的行為學(xué)改變及其測定方法進(jìn)行探討,為新生大鼠HIBD的研究提供功能評價(jià)的方法。
方法 24只7日齡新生SD大鼠隨機(jī)分為對照組（n=12）和HIBD組（n=12） , HIBD組大鼠予以缺氧缺血,對照組大鼠僅予以假手術(shù)。生后3周,兩組大鼠予以T迷宮測試及感覺運(yùn)動(dòng)測試對學(xué)習(xí)記憶、空間能力和感覺運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評估。然后處死兩組大鼠 ,取腦組織切片行尼氏染色,計(jì)數(shù)海馬DG區(qū)和皮層區(qū)單位面積神經(jīng)元的數(shù)目,并對行為學(xué)和組織學(xué)的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。
結(jié)果 在行為測試中, HIBD組大鼠的成績顯著低于正常鼠。在T迷宮測試中,兩組在第3,4d的正確率有顯著差異（P=0.049,P<0.001）,HIBD組的正確率（68.3%±26.2% , 66.7%±15.6% ）顯著低于對照組（86.7%±15.6%,98.3%±5.7%）。在感覺運(yùn)動(dòng)測試中 ,與正常鼠比較 , H I BD鼠在足錯(cuò)誤和肢體放置測試中表現(xiàn)出左右運(yùn)動(dòng)的不對稱 （均 P < 0 . 001） ,姿勢反射也顯示出了運(yùn)動(dòng)功能異常 （ P = 0 . 032）。缺氧缺血導(dǎo)致了神經(jīng)元損傷 ,使海馬 DG區(qū) （39 . 7 ±5 . 9 vs 50 . 9 ±4 . 1, P < 0 . 001）和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元 （12 . 7 ±3 . 3 vs 18 . 2 ±3 . 3, P < 0 . 001）數(shù)目顯著減少。但行為學(xué)測試結(jié)果與組織學(xué)改變無相關(guān)性。
結(jié)論 新生鼠缺氧缺血會(huì)造成遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶 ,空間能力和感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙 , T迷宮測試和三項(xiàng)感覺運(yùn)動(dòng)測試可以作為大鼠 H I BD模型的評價(jià)指標(biāo)。
[關(guān)鍵詞 ] 缺氧缺血，腦行為學(xué)，新生大鼠
缺氧缺血性腦?。?hypoxic2ischemic encephal opa2thy, HIE）是新生兒期zui常見的腦損傷病因,也是腦癱、精神發(fā)育遲滯、學(xué)習(xí)障礙和癲癎的常見原因[1]。
Rice法制作的新生鼠缺氧缺血性腦損傷 （ hypoxic2ischemic brain damage, H I BD）模型,采用 7日齡的新生大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后暴露于低氧環(huán)境下制作而成。7日齡的大鼠處于腦發(fā)育的高峰期,此時(shí)缺氧缺血造成的腦損傷與圍產(chǎn)期窒息造成的足月兒腦損傷相似[2],是研究 H IE損傷機(jī)制和保護(hù)因素的常用動(dòng)物模型。對HIBD有保護(hù)作用的治療措施除了能減輕神經(jīng)元損傷外 ,更重要的是應(yīng)該能改善腦損傷造成的遠(yuǎn)期功能改變。然而,目前對HIBD的保護(hù)研究多采用病理學(xué)和生化指標(biāo) ,較少對遠(yuǎn)期功能進(jìn)行評價(jià)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng) ,特別是未成熟腦中,組織的修復(fù)和代償機(jī)制會(huì)影響遠(yuǎn)期的損傷情況和功能恢復(fù),因此近期的病理或行為評估不一定和遠(yuǎn)期評估的結(jié)果一致[ 3, 4 ]。
HIBD是一種彌漫性腦損傷 ,可以造成單側(cè)腦皮層、紋狀體和海馬損傷[2,5]。皮層損傷可以導(dǎo)致感覺運(yùn)動(dòng)功能受損[4];紋狀體損傷會(huì)導(dǎo)致自發(fā)運(yùn)動(dòng)的改變[5],而海馬損傷則會(huì)導(dǎo)致空間記憶和學(xué)習(xí)能力下降[6]。但在新生鼠HIBD模型中,紋狀體損傷
僅會(huì)導(dǎo)致近期自發(fā)運(yùn)動(dòng)改變 ,在斷奶后 ,這種功能缺陷將會(huì)恢復(fù)[5]。因此,本研究參照 Balduini[5]和Bona〔4〕的行為學(xué)測試方法對大鼠缺氧缺血后遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)記憶、空間能力和感覺運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評估,為HIBD的干預(yù)研究提供評價(jià)手段。
1 材料與方法
1 . 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
新生清潔級Sprague2Dawley大鼠,雌雄不限,體重在12g以上,隨機(jī)分為對照組和HIBD組 ,每組12只。新生大鼠均由母鼠母乳喂養(yǎng),21日齡時(shí)斷奶,雌雄分籠。予以清潔飲食飲水,室溫維持在22℃,予以12h光照,12h黑暗。
1 . 2 HIBD模型制作
H I BD組大鼠7日齡時(shí)乙迷吸入麻醉,分離、結(jié)扎、斷開左頸總動(dòng)脈,縫合皮膚后放回母鼠籠恢復(fù)2h,而后將之放入8%的氮氧混合氣的37℃恒溫箱2 h。對照組大鼠于7日齡行假手術(shù),僅予分離左頸總動(dòng)脈,不予以結(jié)扎和缺氧。
1 . 3 行為學(xué)測試
均采用雙盲法進(jìn)行 ,即行測試者不知道動(dòng)物的分組。
1 . 3 . 1 T迷宮覓食試驗(yàn) （T maze test） T迷宮為木制,每條臂寬11 cm,高18 cm,長40 cm,起始臂末端 15 cm處設(shè)有閘門。自 22日齡起檢測。在 T迷宮左右兩臂的末端放置一個(gè)直徑為 5 cm的器皿 ,內(nèi)置 40 mg的食物 ,測試動(dòng)物在 T迷宮中進(jìn)行 2 d的覓食適應(yīng)后開始測試。測試分為預(yù)備和測試兩個(gè)階段。預(yù)備階段時(shí) ,任意選擇 T迷宮的一臂 ,用木閘門將之關(guān)閉 ,動(dòng)物只能進(jìn)入開放的臂內(nèi),并將食物吃完 ,然后將之放入起始臂內(nèi) ,關(guān) 15 s后撤去所有的閘門開始測試 ,在這一階段,動(dòng)物的后肢進(jìn)入兩臂中的任一臂就認(rèn)為是作出了選擇 ,不準(zhǔn)再后退。如果動(dòng)物進(jìn)入預(yù)備階段未進(jìn)入的臂內(nèi) ,就允許其吃完食物后回籠;如果進(jìn)入已進(jìn)入過的臂內(nèi) ,將其在該臂內(nèi)關(guān) 10 s后回籠。每只動(dòng)物每日測試 5次 ,每次間隔
15 min,連續(xù) 4 d。記錄每日測試的正確率。
1 . 3 . 2 感覺運(yùn)動(dòng)功能測試（ sens ori mot or functi ontest） 包括以下三項(xiàng)試驗(yàn)。待大鼠達(dá)34日齡時(shí)進(jìn)行測試。
1 . 3 . 2 . 1 足錯(cuò)誤（ foot2 faults test） 將大鼠放在水平的金屬網(wǎng)格上（50cm×40cm,每格3cm×3cm,金屬直徑為0.4cm） ,記錄2min爪子落入網(wǎng)格中的次數(shù) ,為排除不同大鼠活動(dòng)度的差別的影響,只將左右側(cè)錯(cuò)誤次數(shù)的差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1 . 3 . 2 . 2 姿勢反射（postural reflex test）抓住大鼠的尾巴,使之懸掛于距離桌面50cm高處。正常鼠將兩個(gè)前肢都伸向桌面 （0分） ,而有腦損傷的大鼠損傷大腦半球?qū)?cè)（右側(cè)）的肢體呈屈曲狀 （1分） ,然后將大鼠放在桌上 ,在肩后的側(cè)面加壓直到前肢伸直 ,重復(fù)數(shù)次 ,如果損傷大腦半球?qū)?cè)（右側(cè)）的抵抗力減弱為異常 （2分）。
1 . 3 . 2 . 3 肢體放置（li mb2 p lacing test） 記錄大鼠在不同的感覺刺激下左右側(cè)前后爪的放置情況,計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下: 0分,爪子放置正確、迅速; 1分,遲緩或不*正確; 2分,不能放置。記錄每只鼠兩側(cè)得分的差值。① 將大鼠放于桌面 ,正常情況下大鼠會(huì)伸展前爪放于桌上; ②用手指抬起大鼠頭部以避免其看見桌面 ,將大鼠的前肢接觸桌子邊緣檢測前肢的感覺; ③大鼠面向桌子的邊緣檢測前肢的放置。正常鼠將雙前爪放于桌上;而腦損傷鼠對側(cè)爪放置錯(cuò)誤; ④ 檢查者將大鼠握住緩慢向桌子邊緣移動(dòng),檢測前、后肢體的放置; ⑤將大鼠放在桌上,輕輕地從側(cè)邊將之推向桌子邊緣,正常大鼠會(huì)抓住桌子邊緣,而腦損傷大鼠對側(cè)的前、后肢可能會(huì)掉下來; ⑥同⑤,只是從后面推。
1 . 4 組織切片及染色
HIBD后4周將大鼠處死, 4%多聚甲醛灌注并取腦組織固定后石臘包埋,制成3μm的石臘切片,脫臘水化后行尼氏染色。取前囟和前囟后3mm部位行尼氏染色,0.1%甲苯胺蘭60℃溫染1min,水洗,70% ,80%酒精脫水,95%酒精鏡下分化,直至細(xì)胞核和背景為淡藍(lán)或無色,100%酒精脫水,*透明,封片。光鏡下（×200）在相同部位取單位面積計(jì)數(shù)神經(jīng)元。
1 . 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
全部資料用SPSS11.0軟件包統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以?x ±s表示 ,均數(shù)比較用t檢驗(yàn);等級資料比較用Mann2 whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)分析采pears on相關(guān)分析（計(jì)量資料）或s pearman相關(guān)分析（等級資料）。
2 結(jié)果
2 . 1 行為學(xué)測試
2 . 1 . 1 T迷宮測試 各組在連續(xù)4 d的試驗(yàn)中,正確率如表 1所示。隨著天數(shù)的增加,對照組正確率逐漸增高,而HIBD組正確率上升不明顯,說明學(xué)習(xí)能力較差。在第 3, 4 d時(shí),差異有顯著性意義。
2 . 2 感覺運(yùn)動(dòng)功能測試
2 . 2 . 1 足錯(cuò)誤 HIBD組右左差值（3.0±1. 0）較對照組 （ 0 . 7 ±1 . 3）顯著增高 （ t = 2 4 . 841, P <0 . 001） ,說明該組大鼠左右運(yùn)動(dòng)不對稱 ,右側(cè) （缺血腦對側(cè) ）差于左側(cè)。
2 . 2 . 2 姿勢反射 在姿勢反射測試中各組大鼠得分情況。得分越高提示腦損傷越嚴(yán)重。對照組 12例均為 0分 ,而 H I BD組僅 8例為 0分 ,兩組差異有顯著意義 （ Z = 2 2 . 145, P = 0 . 032） 。
2 . 3 尼氏染色
缺氧缺血導(dǎo)致了神經(jīng)元損傷 ,使海馬 DG區(qū)和皮層單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少 （均 P <0.01） （表3,圖2）。
2 . 4 組織學(xué)與行為學(xué)結(jié)果的相關(guān)分析將 H I BD大鼠海馬 DG區(qū)單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目與 T迷宮測試第 4 d的正確率進(jìn)行相關(guān)分析 ,兩者無相關(guān)性 （ r = 2 0 . 043, P = 0 . 896 ）。將 H I BD大鼠皮層區(qū)單位面積內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目與三項(xiàng)感覺運(yùn)動(dòng)得分之和進(jìn)行相關(guān)分析 ,兩者也無相關(guān)性 （ r s =0 . 286, P = 0 . 368）。
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