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　　【中國儀器網(wǎng) 行業(yè)應(yīng)用】蛋白質(zhì)間的相互作用存在于生物體每個細胞的生命活動過程中，互交叉形成網(wǎng)絡(luò)，成細胞中一系列重要生理活動的基礎(chǔ)。其中，多數(shù)蛋白質(zhì)是通過與配體分子結(jié)合或者是作為1個大的生物復(fù)合體的一部分，與細胞完整性維持、遺傳物質(zhì)復(fù)制、基因表達調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等一系列生命過程。研究蛋白質(zhì)間相互作用的方式和程度，將有助于蛋白質(zhì)功能的分析、疾病致病機理的闡明和治療和新型藥物的開發(fā)等眾多難題的解決。因此，確定蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系、繪制相互作用圖譜已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點。近年來有許多方法被用于蛋白質(zhì)相互作用的研究，酵母雙雜交技術(shù)，免疫共沉淀技術(shù)，串聯(lián)親和純化技術(shù)，化學(xué)交聯(lián)技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)等。
 

　　酵母雙雜交技術(shù)
 

　　Fields和song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立起來的，是在真核細胞中檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法。該系統(tǒng)是通過兩個分別稱之為“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”的融合蛋白形成一個完整的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活報告基因的表達，通過在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長或呈現(xiàn)顯色反應(yīng)來檢測系統(tǒng)的功能。酵母雙雜交系統(tǒng)可在全基因組規(guī)模上進行蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用高通量的研究。
 

　　免疫共沉淀技術(shù)
 

　　免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細菌的Protein A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Agarose珠上的Protein A或G，若細胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物——“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein A或G”，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
 

　　串聯(lián)親和純化技術(shù)
 

　　串聯(lián)親和純化(TAP)是一種能快速研究體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)，經(jīng)過兩步特異性親和純化，可快速得到生理條件下與靶蛋白質(zhì)存在真實相互作用的蛋白質(zhì)。該技術(shù)通過在靶蛋白質(zhì)一端嵌入一個特殊的蛋白質(zhì)標(biāo)簽(TAPtag)，不破壞靶蛋白質(zhì)調(diào)控序列，且靶蛋白質(zhì)表達量與體內(nèi)水平相當(dāng)；經(jīng)過兩步連續(xù)的親和純化獲得接近自然條件的特定蛋白質(zhì)復(fù)合體，后用質(zhì)譜技術(shù)或Edman 降解法進行蛋白質(zhì)鑒定。與傳統(tǒng)的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)相比，TAP 技術(shù)具有周期短、假陽性結(jié)果少等優(yōu)點。
 

　　化學(xué)交聯(lián)技術(shù)
 

　　交聯(lián)劑是能在線型分子間起架橋作用從而使多個線型分子相互鍵合交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。 促進或調(diào)節(jié)聚合物分子鏈間共價鍵或離子鍵形成的物質(zhì)?；瘜W(xué)交聯(lián)劑是能夠和蛋白質(zhì)反應(yīng)的帶有雙功能團的化學(xué)試劑。通過功能團和氨基酸殘基反應(yīng)，偶聯(lián)兩個蛋白質(zhì)或者更多的蛋白質(zhì)形成網(wǎng)狀交聯(lián)。功能團決定了交聯(lián)劑的反應(yīng)特異性。 化學(xué)交聯(lián)試劑捕獲感興趣的發(fā)生了相互作用的蛋白質(zhì)對，結(jié)合生物質(zhì)譜的高解析能力，快速、高通量地獲取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。
 

　　蛋白質(zhì)芯片技術(shù)
 

　　蛋白質(zhì)芯片是一種新型的生物芯片，是由固定于不同種類支持介質(zhì)上的蛋白微陣列組成，陣列中固定分子的位置及組成是已知的，用未經(jīng)標(biāo)記或標(biāo)記(熒光物質(zhì)、酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記)的生物分子與芯片上的探針進行反應(yīng)，然后通過特定的掃描裝置進行檢測，結(jié)果由計算機分析處理。
 

　　蛋白質(zhì)芯片具有以下特點: 1)特異性強。這是由抗原抗體之間、蛋白與配體之間的特異性結(jié)合決定的；2)敏感性高?？梢詸z測出樣品中微量蛋白的存在，檢測水平已達ng級；3)通量高。在一次實驗中對上千種目標(biāo)蛋白同時進行檢測，效率*；4)重復(fù)性好；不同次實驗間相同兩點之間差異很小；5)應(yīng)用性強。樣品的前處理簡單，只需對少量實際標(biāo)本進行沉降分離和標(biāo)記后，即可加于芯片上進行分析和檢測；6)適用范圍廣。適用于包括組織、細胞系、體液在內(nèi)的多種生物樣品。
 

　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)
 

　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是指兩個熒光基團間能量通過偶極一偶極耦合作用以非輻射方式從供體傳遞給受體的現(xiàn)象，可被用于測定分子間的距離。FRET熒光探針主要有熒光蛋白、有機熒光染料、鑭系染料和量子點，F(xiàn)RET方法的特點是適用于活細胞和固定細胞的各類分子，靈敏度和分辨率高，并能清晰成像，直觀地提供蛋白質(zhì)相互作用的定位和定量信息，因而受到廣泛重視。
 

　　噬菌體展示技術(shù)
 

　　噬菌體展示技術(shù)是一種親和選擇和基因表達產(chǎn)物相結(jié)合的技術(shù)，以改造的噬菌體為載體，將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)，通過檢測病毒內(nèi)部的DNA來測定融合蛋白序列。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使得各種靶分子的多肽配體通過一種被稱為淘選的體外選擇程序得以快速鑒定。
 

　　下面舉一個具體的例子來說明酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用
 

　　酵母雙雜交技術(shù)
 

　　水稻條紋葉枯病是東亞地區(qū)普遍發(fā)生的毀滅性水稻病害，被稱為水稻上的“癌癥”。其病原是水稻條紋病毒(RSV)，RSV 具有*的基因組結(jié)構(gòu)和編碼策略， 它由4條RNA鏈組成，其核苷酸共參與編碼7個蛋白，包括RdRp、NS2、NSvc2、CP、NS3、SP、NSvc4。
 

　　目前，研究蛋白一蛋白相互作用經(jīng)典的方法當(dāng)屬酵母雙雜交技術(shù)。該技術(shù)幾乎能進行整個細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用的篩選，包括膜蛋白、轉(zhuǎn)錄活性蛋白以及定位于不同亞細胞結(jié)構(gòu)的蛋白。它具有簡便、靈敏、、高通量和價格相對低廉的特點。但該方法也存在有一定的局限性。首先，許多已知的相互作用并沒有在大規(guī)模的篩選中被鑒定出來，表明這種方法存在這較高的的假陰性，其主要原因有：篩選方法不同檢測到的蛋白間的互作也不同。例如經(jīng)典的酵母的雙雜交系統(tǒng)只能檢測到核內(nèi)蛋白，對胞質(zhì)蛋白和膜蛋白則檢測不到；融合的報告蛋白很可能空間排列受阻，從而影響蛋白的互作；有些蛋白間的互作是瞬間發(fā)生的，目前一些方法很難檢測到，的真核生物在酵母中表達的蛋白缺乏轉(zhuǎn)錄后修飾，因此發(fā)生的互作很難檢測到；報告基因的缺陷；RNA聚合酶1的變化等等。其次，假陽性可以反映蛋白質(zhì)間非特異性相互作用，也就是說捕獲蛋白能與許多不同的誘餌蛋白相互作用，即薪性捕獲，這可能是由于有些蛋白需要與多個蛋白質(zhì)相互作用才能正常使用其功能，如分子伴侶；同時，誘餌蛋白和捕獲蛋白可能存在自激活能力，不需要發(fā)生蛋白質(zhì)間的互作就能激活報告基因的表達；有些蛋白存在于不同的組織中，或在發(fā)育的不同時間表達，或分布在細胞不同的區(qū)域，它們在正常情況下不可能發(fā)生互作卻被檢測到了，這樣的互作也是一種假陽性。要想檢測雙雜交中篩選到的相互作用是否真實，還需進行其他的驗證實驗再次驗證。除此之外，通過統(tǒng)計學(xué)方法可以給每一個相互作用一個可靠度分值，從而能夠排除許多假陽性。
 

　　酵母雙雜交系統(tǒng)的建立，發(fā)展和完善為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展提供了有效的途徑。隨著后基因組時代的發(fā)展，人們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究將不斷深入，這就需要更，更便捷的新的互作系統(tǒng)被開發(fā)出來。同時，隨著細胞內(nèi)大規(guī)模的蛋白質(zhì)動態(tài)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)互作組學(xué)必將進入一個全新的發(fā)展階段。