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更多> 培養(yǎng)前的工作準(zhǔn)備充分
包括耗材的處理、試劑的配置,無菌檢驗(yàn)等等。
玻璃器皿的清洗。對(duì)于玻璃器皿(細(xì)胞瓶、裝營(yíng)養(yǎng)液的瓶子、小青霉素瓶等)要先用洗衣粉刷干凈(注意死角),然后沖干凈。用酸液浸泡 24 h 以上,之后用清水沖洗 10 遍,除去殘留酸液。瓶子之類,沖洗過程要使勁搖晃。然后在雙蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎,使用鼓風(fēng)干燥箱160℃ 干烤 2 h 待用。
試劑配置。細(xì)胞培養(yǎng)用的液體一般使用雙蒸以上的水即可。并注意 pH 值的調(diào)節(jié)。
無菌檢驗(yàn)。主要采用過濾除菌:如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各類培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。有些可以采用高壓滅菌:如 PBS、D-Hank's等。
試劑分裝保存
包括營(yíng)養(yǎng)液、胰酶、血清等。
血清特別重要。血清必須貯存于 –20℃低溫培養(yǎng)箱,如果一次無法用完一瓶,可將 40~50ml 分裝于無菌酸處理瓶中,甚至置青霉素瓶保存。一般廠商提供的血清為無菌,不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾,勿直接過濾血清。(一般情況下不影響細(xì)胞培養(yǎng))
瓶裝血清一定要逐步解凍: 4℃ 冰箱全溶后再分裝,在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一,減少沉淀的發(fā)生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。
熱滅活是指 56℃,30 分鐘加熱已*解凍之血清。水浴鍋升到 56℃后,將血清放入,待溫度升高到 56℃ 后計(jì)時(shí),一般 5 分鐘左右規(guī)則搖晃均勻一次。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必須,一般不要作此熱處理,因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多,且會(huì)影響血清之品質(zhì)。注意更換新血清(包括不同批次)對(duì)細(xì)胞的影響。
無菌意識(shí)要強(qiáng)
實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,超凈臺(tái)以紫外燈照射 30 分鐘滅菌,以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面,并開啟超凈工作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)分鐘后,才開始實(shí)驗(yàn)操作。
每次操作只處理一株細(xì)胞株,以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后,將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái),以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。
無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞,必要物品,例如支架、吸管等公用物品可以暫時(shí)放置,其它個(gè)人實(shí)驗(yàn)用品用完應(yīng)立即拿出。實(shí)驗(yàn)用品以 70% 乙醇擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在*無菌區(qū)域,一般勿在邊緣區(qū)域操作。
小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約 45° 角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
選擇正確的培養(yǎng)基
不同的細(xì)胞可能培養(yǎng)基不同,甚至不同的文獻(xiàn)可能對(duì)相同的細(xì)胞培養(yǎng)基成分也是可能不同的。當(dāng)時(shí)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,有文獻(xiàn)就選用 neurobase 培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕亲隹寡趸脱趸矫娴?,而這種培養(yǎng)基中含有抗氧化劑成分,此時(shí),不得不選擇另外一種不含抗氧化劑的培養(yǎng)基。
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