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【中國(guó)儀器網(wǎng) 使用手冊(cè)】一種物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中振搖，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，在同一溫度下，該物質(zhì)在兩相溶劑中濃度的比值是恒定的，這個(gè)比值就稱為該物質(zhì)在這兩種溶劑中的分配系數(shù)。在天然藥物提取分離工作中常用的溶劑萃取，就是利用天然藥物中化學(xué)成分在互不相容的兩相溶劑中的分配系數(shù)不同從而使其達(dá)到分離的。如果需要分離的物質(zhì)在兩相溶劑中的分配系數(shù)相差很小，則一般用液-液萃取的方法是無(wú)法使其分離的，必須使其在兩相溶劑中不斷的反復(fù)分配，才能達(dá)到分離的目的，而分配色譜就能起到使其在兩相溶劑中不斷的進(jìn)行反復(fù)分配提取的效用。
分配色譜的基本原理
分配色譜法是用一種多孔性物質(zhì)作為支持劑，將極性溶劑在色譜過(guò)程中始終固定在支持劑上，因它在色譜過(guò)程中始終是不移動(dòng)的，故稱之為固定相。用另一種極性較小的溶劑來(lái)洗脫，因它在色譜過(guò)程中始終是移動(dòng)的，故稱為移動(dòng)相。由于移動(dòng)相連續(xù)的加入，混合物中各成分一次又一次的在固定相與移動(dòng)相之間按其分配系數(shù)進(jìn)行無(wú)數(shù)次的分配，實(shí)際上就是移動(dòng)相把成分從固定相中連續(xù)不斷的提取出來(lái)并向前移動(dòng)。結(jié)果是在移動(dòng)相中分配量大的成分移動(dòng)速度快，走在前頭；在移動(dòng)相中分配量小的成分移動(dòng)速度慢，走在后頭，從而使混合物中各成分達(dá)到彼此分離的目的。將支持劑裝在柱中的稱為柱分配色譜，以濾紙作為支持劑的稱為紙上分配色譜。
柱分配色譜所用的支持劑有硅膠、硅藻土、纖維素等。硅膠由于規(guī)格不同，往往使分離結(jié)果不易重現(xiàn)。硅藻土由于所含的氧化硅質(zhì)地較致密，幾乎不發(fā)生吸附作用。用纖維素作為支持劑進(jìn)行分配色譜，實(shí)際上相當(dāng)于紙色譜的擴(kuò)大。
使用分配色譜的分離工作難易主要決定于混合物中各成分的分配系數(shù)的差異，如果分配系數(shù)相差較大，只要用較小的柱和較少的硅膠(支持劑)就能獲得滿意的分離。如果分配系數(shù)相差較小，則分離同樣重量的樣品往往需要用較大的柱和較多的硅膠才能分開(kāi)。通常在溶劑萃取中，所用的兩相溶劑比大致為1:1，而在分配色譜中移動(dòng)相的體積常常大于固定相5-10倍，在某些情況下甚至更大，即相當(dāng)于以5-10倍甚至更大體積的有機(jī)溶劑向水溶液萃取，而分配系數(shù)的含義為溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比，若體積增大，實(shí)際抽提出的量也大。因此在分配色譜中選擇固定相和移動(dòng)相時(shí)，要考慮樣品在兩相溶劑中的分配比(樣品在移動(dòng)相中的濃度/樣品在固定相中的濃度)，通常其分配系數(shù)選擇在0.1-0.2為宜。分配系數(shù)較大時(shí)，則很快會(huì)從柱上被洗脫下來(lái)，分離效果較差。如果分配系數(shù)過(guò)大則可采用反相分配色譜的方法進(jìn)行分離，即以極性較小的溶劑作固定相，極性較大的溶劑作移動(dòng)相。
原則上各類化合物均可用分配色譜的方法進(jìn)行分離，但在實(shí)際工作應(yīng)用中由于反相分配色譜是用得較少，主要是用于一些水溶性較大的化合物的分離如皂苷類、糖類、氨基酸類、極性較大的強(qiáng)心苷類、有機(jī)酸類、酚性化合物等。
分配色譜的一般操作
分配色譜的基本操作與吸附色譜大體相同，但也有它的特殊性，在使用時(shí)要引起注意，否則會(huì)直接影響它的分離效果。
1．裝柱
裝柱前要先將支持劑與一定量的固定相攪拌混合均勻，然后將混有固定相的支持劑倒入盛有移動(dòng)相溶劑的柱中，按一般濕法裝柱操作方法進(jìn)行操作。通常支持劑和固定相溶劑的用量比為1:0.5-1.0，即1克支持劑加0.5-1克固定相溶劑。因分配色譜是使用不相互溶的兩種溶劑，所以必須預(yù)先使兩相溶劑相互飽和，即將兩相溶劑放在一起振搖，待分層后再分別取出使用，至少移動(dòng)相應(yīng)先用固定相飽和后再使用。否則，在色譜進(jìn)行過(guò)程中當(dāng)通過(guò)大量移動(dòng)相溶劑時(shí)，就會(huì)把支持劑中的固定相溶劑溶解出來(lái)，后只剩下了支持劑，也就不成為分配色譜了，并有可能導(dǎo)致整個(gè)分離的失敗。
色譜柱固定相支持劑段直徑與長(zhǎng)度的比為通常為1:10-20，，對(duì)分配系數(shù)比較接近的成分的分離，往往可加大到1:40以上。一般一米長(zhǎng)的色譜柱的分離效果能相當(dāng)于數(shù)百支逆流分溶管或數(shù)百個(gè)分液漏斗的萃取效果。
支持劑的用量通常較吸附色譜大，一般樣品與支持劑的用量之比為1:100-1000。其具體用量主要取決于分離工作的難易，對(duì)分配系數(shù)比較接近的成分的分離甚至可采用1:10000。
物質(zhì)的分配系數(shù)往往會(huì)因溫度的變化而改變，因此對(duì)要求較高的實(shí)驗(yàn)，色譜管好有隔層套管，以便通水保持恒定的溫度。
2．樣品的加入
樣品上柱有三種方法：如樣品能溶于移動(dòng)相溶劑，可用少量移動(dòng)相溶劑溶解，加于柱頂再行展開(kāi)；如樣品難溶于移動(dòng)相而易溶于固定相時(shí)，則可用少量固定相溶劑溶解，再用支持劑(硅膠)吸著，裝于柱頂再行展開(kāi)；如果樣品在兩相溶劑中的溶解度均不大，則可另選其他有機(jī)溶劑溶解后，加干燥支持劑拌勻 ，待溶劑揮發(fā)除盡后，加0.5-1.0倍量固定相溶劑拌勻，再裝于柱頂。
3．洗脫
加樣完畢后，用移動(dòng)相溶劑進(jìn)行洗脫，分別收集各餾分，回收溶劑，用薄層色譜等方法檢查，相同者合并。所用的移動(dòng)相溶劑常為固定相溶劑的5-10倍，即相當(dāng)于用5-10倍體積的有機(jī)溶劑向水溶液反復(fù)提取(如果以水為固定相)。
在分配色譜進(jìn)行過(guò)程中，要盡量使溶質(zhì)在兩相溶劑之間達(dá)到平衡，故移動(dòng)相溶劑的流速應(yīng)慢些。通常要根據(jù)色譜柱的橫斷面和成分的分離難易程度來(lái)調(diào)整流速。
4．溶劑系統(tǒng)的選擇
主要根據(jù)有效成分和雜質(zhì)的溶解度來(lái)選擇適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)，也可借助硅膠分配薄層色譜或紙層色譜的結(jié)果來(lái)摸索分離條件，或者查閱前人分離同類型化合物時(shí)的資料作為參考。一般來(lái)講，生物堿類或酸性物質(zhì)可用緩沖溶液作固定相。
近年來(lái)，在使用硅膠柱色譜分離皂苷等極性較大的化合物時(shí),常以含水的溶劑如氯仿-甲醇-水、二氯甲烷-甲醇-水等作為洗脫劑，由于在洗脫過(guò)程中硅膠會(huì)逐漸吸附洗脫劑中的水，使硅膠中的水分逐漸增大，故可以認(rèn)為該類色譜開(kāi)始時(shí)是脫活硅膠的吸附色譜，但隨著硅膠中水的增多即固定相的增加，就逐漸變?yōu)楣枘z分配色譜了。
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