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學(xué)習(xí)Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟
學(xué)習(xí)Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟
注意事項：
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先*化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。
Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞
細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒
進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。
收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要
采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生
產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒。
2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配
膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋
白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 組織塊稱重
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊
3. 加入RIPA緩沖液(每克組織3 ml RIPA)，PMSF(每克組織30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron進(jìn)一步勻漿(15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘)維持4℃
4. 加入PMSF(每克組織30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分鐘
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g(約15,000轉(zhuǎn))15分鐘
6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存
7. 進(jìn)行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度
8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度)，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9. 沸水浴中3分鐘
10. 上樣
11. 電泳(濃縮膠20mA，分離膠35mA)
12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100mA 40分鐘)
13. 膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色
14. Westernblot 試劑盒顯色
15. 分析比較記錄
western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項的資料
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1)轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4)將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
5)按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。
6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7.袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8.混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體(10毫升)，加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時(或4℃過夜)
9.用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10. 將連接*的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時。
11.按步驟9洗滌。
12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)，于室溫下?lián)u動。
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