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生化培養(yǎng)箱在多管發(fā)酵法的應(yīng)用

1 .多管發(fā)酵法

　　初發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵管內(nèi)裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，并在內(nèi)倒置有小玻璃管。每個(gè)樣品用三個(gè)不同的水樣量接種，同一接種水樣量要有五管，將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養(yǎng)液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)液即由原來的紫色變成黃色。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗(yàn)陽性，如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍發(fā)酵管，有小氣泡升起為陽性。

　　復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 輕微振蕩初發(fā)酵試驗(yàn)陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)將培養(yǎng)物(2-3環(huán))轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h(提高培養(yǎng)溫度可造成不利于來自自然環(huán)境的大腸菌群的生長)。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。

　　2.濾膜法

　　濾膜是一種微孔性濾膜，孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中，經(jīng)過抽濾，細(xì)菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于M-FC培養(yǎng)基上，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養(yǎng)基上呈藍(lán)色或藍(lán)綠色，其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無色。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用，在M-FC培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落。

　　二.兩種方法的注意事項(xiàng)

　　1.培養(yǎng)溫度的要求 總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在，但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的合適溫度為25℃左右，如在37℃培養(yǎng)則仍可生長，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5℃，則不再生長，而直接來自糞便的大腸菌群細(xì)菌，習(xí)慣于37℃左右生長，如將培養(yǎng)溫度升高至44.5℃仍可繼續(xù)生長。因此，可用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分，兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養(yǎng)基放入 培養(yǎng)皿要沉到水浴箱底部。

　　2.加氯水樣的處理 經(jīng)氯處理消毒過的水樣，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態(tài)，在采集水樣時(shí)應(yīng)提前在采樣瓶中加*，*可以脫氯，使受損的細(xì)菌得以復(fù)蘇與修復(fù)，從而避免出現(xiàn)計(jì)數(shù)結(jié)果偏低甚至假陰性的現(xiàn)象。此外余氯對(duì)濾膜法培養(yǎng)的細(xì)菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時(shí)應(yīng)對(duì)水樣進(jìn)行大量無菌水稀釋，以減少余氯的殘留。

　　3.樣品的保存 采樣用的容器使用前應(yīng)蓋好瓶蓋，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要，如保存不當(dāng)可使樣品中的大腸菌群細(xì)菌死亡或在一定條件下再生長，這些都將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)室接到水樣后，應(yīng)立即檢測(cè)，如因故不能檢測(cè)時(shí)，應(yīng)立即將樣品置于冰箱內(nèi)(2℃-10℃)并于2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

　　4.培養(yǎng)物質(zhì)的制備與保存

　?、?多管發(fā)酵法所使用的培養(yǎng)液在分裝于各發(fā)酵管中后，應(yīng)將發(fā)酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min(注意：這個(gè)溫度也應(yīng)控制好，既達(dá)到滅菌的作用，還要防止培養(yǎng)物質(zhì)分解流失)，然后貯存于冰箱或暗處備用。

　　⑵.濾膜法所采用的M-FC培養(yǎng)基多使用外購的成品，培養(yǎng)基中苯胺藍(lán)的純度和質(zhì)量往往影響菌落的顏色，因此，無菌包裝的成套培養(yǎng)基在使用前，先接種典型糞大腸菌，以觀察對(duì)比菌落的顏色，來鑒定其穩(wěn)定性。

　　5.結(jié)果統(tǒng)計(jì)

　　⑴.多管發(fā)酵法的結(jié)果是根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目，從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù)，來計(jì)算每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫，指大可能數(shù)，它是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，估計(jì)水體中的菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法，所以準(zhǔn)確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽性數(shù)是非常重要的，否則將導(dǎo)致較大偏差。

　?、?濾膜法的結(jié)果是計(jì)數(shù)濾膜上呈藍(lán)或藍(lán)綠色的菌落，來計(jì)算出每升水樣中的糞大腸菌群數(shù)。所以為便于計(jì)數(shù)，減少誤差，理想的水樣體積是一片濾膜上生長20-60個(gè)糞大腸菌群菌落。

　　三.在實(shí)際中的應(yīng)用探討

　　1.檢測(cè)方法對(duì)樣品的適用性

?、?多管發(fā)酵法由于只需要根據(jù)水樣的取樣量來決定將樣品培養(yǎng)于何種培養(yǎng)液中(單倍或是三倍乳糖)進(jìn)行培養(yǎng)，因此理論上可適用于各種水樣，但由于受發(fā)酵管容積的限制，其更適合檢測(cè)水源水、地表水和污染源廢水(取樣量不大)，而且如果接種的水樣量不是MPN表中的三種接種量時(shí)，還需用公式進(jìn)行換算。

　?、?濾膜法主要是采用抽濾裝置將細(xì)菌截留在濾膜上，然后將濾膜貼附在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此可用于檢測(cè)體積較大的水樣，但受濾膜孔徑的限制，在檢測(cè)混濁度高(污染源廢水)、非大腸桿菌類細(xì)菌密度大(河湖水)的水樣時(shí)，對(duì)菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)有一定影響，此外，如水樣中有毒性物質(zhì)較高，也會(huì)在濾膜上形成累積，抑制細(xì)菌培養(yǎng)。

　　2.檢測(cè)時(shí)間及操作過程的繁瑣度

　?、?多管發(fā)酵法需要經(jīng)過初發(fā)酵試驗(yàn)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)兩個(gè)過程后才能根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目，從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù)，從而后得出每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值。可以看出，多管發(fā)酵法的培養(yǎng)時(shí)間至少需要2天以上，且對(duì)接種量、每一接種量的發(fā)酵管數(shù)都有嚴(yán)格要求(MPN表多采用9管、15管發(fā)酵管，接種量為10ml、1ml、0.1ml3種體積查詢)，否則結(jié)果難以統(tǒng)計(jì)。

　?、?濾膜法目前主要采用成套NPS(濾膜+培養(yǎng)基+培養(yǎng)皿)進(jìn)行細(xì)菌截留和培養(yǎng)，操作簡單，使用時(shí)只需用少量無菌水潤濕培養(yǎng)基墊即可使用，培養(yǎng)時(shí)間1天左右，能比多管發(fā)酵法更快地獲得結(jié)果，還具有高度的再現(xiàn)性和精密性。此外由于采用單片無菌包裝，節(jié)省了滅菌時(shí)間，還避免操作過程中的二次污染，并且長有菌落的濾膜片可在紫外線滅菌、干燥后作為檢測(cè)記錄保存，更符合計(jì)量認(rèn)證規(guī)范。

　　3.檢測(cè)成本的考慮

　?、?多管發(fā)酵法所用的發(fā)酵管、小玻璃倒管和塑料蓋可在清洗、高壓滅菌和紫外線消毒后重復(fù)使用，液態(tài)培養(yǎng)基可自行配制或采用市售已配好的綜合培養(yǎng)基，檢測(cè)的成本不高。由于其方法較繁瑣，目前正有一種經(jīng)過US EPA認(rèn)證的水和廢水中糞大腸菌群檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法逐步取代它，這種在美國、日本和加拿大等國家廣泛使用的檢測(cè)技術(shù)在國內(nèi)也有一定使用(北京市環(huán)境檢測(cè)中心、北京市排水集團(tuán)檢測(cè)中心等)，這種方法就是使用IDEXX colilert試劑來檢測(cè)水中糞大腸菌，雖然它是基于多管發(fā)酵法原理，不過卻將其操作大大簡化了。當(dāng)然，伴隨著操作的簡化，檢測(cè)成本也大幅提高，設(shè)備基本上全是進(jìn)口的，前期投入大概在8萬元至10萬元人民幣之間，且由于采樣瓶、試劑和密封計(jì)數(shù)盤都是一次性使用，單個(gè)樣品的檢測(cè)成本也將達(dá)到200元人民幣左右。

　?、?濾膜法主要采用的抽濾裝置(拋光不銹鋼3歧管過濾器、500ml漏斗、無油隔膜真空正壓兩用泵和手動(dòng)無菌水加液器)也基本上來自于進(jìn)口，目前很多單位使用的都是德國賽多利斯公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，其前期投入大概在2萬元至3萬元人民幣左右(包括100套無菌包裝的NPS，12元/每套)。由于每個(gè)樣品需采用3種不同的稀釋比進(jìn)行過濾培養(yǎng)，要使用3套NPS，所以單個(gè)樣品的檢測(cè)成本在50元人民幣左右。

　　四.建議

　　從兩者在幾個(gè)方面的比較可以看出，濾膜法具有省時(shí)、省料、設(shè)備要求低以及可以采集較多的檢測(cè)水樣等優(yōu)點(diǎn)，而且隨著應(yīng)急檢測(cè)機(jī)制的建立，當(dāng)需要我們對(duì)各種突發(fā)環(huán)境污染事件(醫(yī)院廢水是否加氯處理、河湖是否受生活廢水污染)迅速做出反應(yīng)，更快地獲得肯定結(jié)果的時(shí)候，其優(yōu)點(diǎn)越發(fā)突出。

因此在實(shí)際檢測(cè)工作中，我們可以將濾膜法作為主要檢測(cè)方法，并采取措施克服其易受水樣混濁度、其它菌種和有毒物質(zhì)干擾的局限性，快速反映水質(zhì)情況，為監(jiān)督管理部門提供科學(xué)數(shù)據(jù);將多管發(fā)酵法作為輔助方法，通過其來對(duì)濾膜法培養(yǎng)的可疑菌種進(jìn)行鑒定，從而使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，只有這樣，水中的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)才能順利、的開展。