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該試劑盒用于從克隆菌中大量提取去除內(nèi)毒素的高品質(zhì)質(zhì)粒，一般來說可從200ml過夜培養(yǎng)的菌液中提取高拷貝質(zhì)粒600-1200ug，低拷貝質(zhì)粒50-400ug。試劑盒自帶的說明書為英文說明書，不是非常方便閱讀，所以本文根據(jù)英文原版重新翻譯了一遍，希望對(duì)大家有幫助。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。
試劑盒型號(hào) 加入的乙醇量(ml)
D6926-00B 60
D6926-01B 160
D6926-03B 200
D6926-04B 200每瓶
細(xì)菌的培養(yǎng)：
1. 在容積為1-4升的培養(yǎng)瓶中加入200ml含篩選抗生素的LB培養(yǎng)基，加入含目的質(zhì)粒的克隆菌(一般為1/1000比例接種，也即200ul)，然后置37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。為了獲得*的效果，*接菌使用經(jīng)過夜培養(yǎng)活化的菌種。對(duì)于大多數(shù)質(zhì)粒的提取，我們強(qiáng)烈*使用endA陰性的菌種，比如DH5α和JM109。
*的培養(yǎng)條件對(duì)于質(zhì)粒DNA的得率至關(guān)重要。*的培養(yǎng)條件包括，首先由新轉(zhuǎn)化或新劃線的培養(yǎng)板中挑取單個(gè)克隆，然后接種于2-5ml含合適篩選抗生素的培養(yǎng)基中，37℃振蕩(搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定在約300rpm為宜)培養(yǎng)約8小時(shí)；然后繼續(xù)接種于含抗生素的預(yù)熱的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩(~300rpm)培養(yǎng)12-16小時(shí)。盛培養(yǎng)基的容器的容積需至少為培養(yǎng)基體積的3-4倍(注：保證培養(yǎng)環(huán)境中有足夠的氧氣，防止厭氧菌的繁殖)，初始培養(yǎng)基接種的稀釋比例為1/500到1/1000為宜。
為了獲得*的效果，我們*每次培養(yǎng)后測(cè)定OD600值。對(duì)于過夜培養(yǎng)活化的細(xì)菌而言，OD600的值處于1.5-2.0之間是細(xì)菌生長(zhǎng)良好的指標(biāo)。在測(cè)定OD600時(shí)，為了保證測(cè)量值處于光度計(jì)測(cè)量的線性范圍(0.1-0.5)，需將培養(yǎng)物進(jìn)行必要的稀釋(10到20倍)。當(dāng)接種進(jìn)行大量培養(yǎng)時(shí)，我們*細(xì)菌的終密度在2.0-3.0之間為宜。當(dāng)使用富營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基，需要注意保證細(xì)菌的密度不要超過OD600為3.0；如果使用凍存的甘油菌，需要首*行劃線并挑取單克隆，然后和前面一樣進(jìn)行必要的活化。
富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基如2xYT或TB，不*使用本試劑盒。
堿性-SDS溶液裂解細(xì)菌：
2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室溫離心10min收集菌體沉淀。
3. 小心去除上清液，為了保證所有上清去除*，可使用干凈的紙巾將容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體，重懸*對(duì)于獲得zui高的得率至關(guān)重要;
4. 加10ml SolutionⅡ，來回顛倒10-15次輕柔混勻，以得到澄清的裂解液。如有必要可室溫孵育2min。
避免混合時(shí)動(dòng)作過于劇烈，過于劇烈會(huì)剪切細(xì)菌的染色體DNA(從而在接下來的步驟中不能被充分沉淀)并且導(dǎo)致質(zhì)粒的純度降低。(當(dāng)Solution II在不使用時(shí)，需要將瓶蓋旋緊，防止空氣中的CO2與Solution II反應(yīng)生成碳酸鹽)
5. 加5ml Buffer N3，輕輕顛倒充分混勻幾次直至白色絮狀沉淀出現(xiàn)。室溫放置2—3min，期間偶爾顛倒混合，以使其充分反應(yīng)。
注意：該溶液必須充分混合。如果混合物依然非常的粘滯，呈褐色并且成團(tuán)狀，則需要進(jìn)一步混合以充分中和該溶液，充分中和對(duì)于獲得更好的得率至關(guān)重要。使用冰預(yù)冷的Buffer N3將有利于沉淀更多的細(xì)菌蛋白。
6. 準(zhǔn)備結(jié)合柱：加5ml的Buffer GPS至結(jié)合柱中，室溫放置3—10min，3,000—5,000×g室溫離心5min，棄濾液(注：這里中文說明書中添加了一步“往柱子里加入10ml無菌水離心棄濾液”，而在英文原版中是沒有的)，把柱子插回50ml收集管中。(注：這里可以使用一個(gè)舊的50ml離心管收集廢液，而將試劑盒中附帶的新離心管用于zui后一步質(zhì)粒洗脫時(shí)使用)。
使用針筒式過濾器過濾裂解物：
7. 將第5步得到的裂解液及沉淀物全部轉(zhuǎn)移至針筒式過濾器中，準(zhǔn)備一個(gè)干凈的50ml離心管收集濾液。將過濾器的活塞插回針筒。
8. 將針筒對(duì)準(zhǔn)50ml收集管，輕輕推動(dòng)活塞，收集澄清的濾液。一些裂解液中可能仍然殘留有絮狀沉淀物，不要強(qiáng)行將這些殘留的裂解液推擠過柱。
9. 加入等體積的ETR Binding Buffer(~25ml)到結(jié)合柱上，上下反復(fù)顛倒7-10次。
使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：離心法，適用于同時(shí)抽提多個(gè)樣品，對(duì)于樣本量較少時(shí)，*使用后面的真空抽濾法)
10. 小心轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱，3,000—5,000×g離心3—5min,使液體濾過柱子，棄濾液。
11. 重復(fù)步驟10，直至所有裂解液都過濾完，棄濾液。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min,使全部液體濾過柱子，棄濾液。
13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
注意：試劑盒附帶的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用無水乙醇稀釋。如果試劑是低溫保存的，使用前需要預(yù)先恢復(fù)溫度至室溫。
15. 加入10ml DNA Wash Buffer到結(jié)合柱上3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
16. 把空柱子套回離心管，zui大轉(zhuǎn)速(不超過6,000×g)離心10—15min使柱子充分干燥。不要跳過該步驟-該步對(duì)于去除柱子中殘留的乙醇非常關(guān)鍵。
使用HiBind結(jié)合柱純化質(zhì)粒DNA(注：真空抽濾法，對(duì)于樣品個(gè)數(shù)較少時(shí)，該方法比較節(jié)省時(shí)間)
10. 安裝好抽濾裝置，將結(jié)合柱與抽濾瓶密閉結(jié)合
11. 轉(zhuǎn)移裂解液至HiBind結(jié)合柱，使液體全部濾過柱子。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結(jié)合柱上，洗滌一次(注：流速可能會(huì)比較慢)。
13. 加入10ml Buffer EHB到結(jié)合柱上，洗滌一次。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預(yù)先添加了乙醇)到結(jié)合柱上，洗滌一次。
15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗滌一次。
16. 繼續(xù)抽真空10-15min，以充分干燥結(jié)合柱(注：當(dāng)抽提多個(gè)樣品時(shí)，可以選擇離心法步驟16中的方法以節(jié)約時(shí)間)。
由結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA(常規(guī)方法，也可以使用后面介紹的另一種洗脫方法)
17. 進(jìn)一步干燥柱子：選擇以下任一種方法在洗脫前進(jìn)一步干燥結(jié)合柱
A. 將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移真空抽濾裝置上室溫抽濾15min
B. 將結(jié)合柱放入65℃恒溫烤箱，烘烤10—15min
18. 把結(jié)合柱套在一個(gè)新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)，加入1—3ml(注：依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度，可以分步兩次洗脫，第1次少量洗脫保證得到高濃度的質(zhì)粒，第二次稍加大洗脫體積，保證盡可能將質(zhì)粒洗脫*) Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2—5min，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min洗脫質(zhì)粒DNA。
上面描述的方法可以回收大約60-80%柱結(jié)合的DNA。也可以選擇進(jìn)行二次洗脫從而將所有殘留的DNA全部回收，但二次洗脫的DNA濃度會(huì)低一些。另外，第二次洗脫也可以使用*洗脫下來的液體以保證得到較高濃度的質(zhì)粒DNA。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會(huì)顯著提升zui終的得率。
注意：使用該方法得到的質(zhì)?？梢院芎玫膽?yīng)用與PCR，限制性酶切，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等。預(yù)期的質(zhì)粒濃度可能依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同存在一些出入。但是，一般來說高拷貝的質(zhì)粒終濃度在150-600ug/ml。該方法得到的質(zhì)?？赡軙?huì)包含一些乙醇?xì)埩簦话悴粫?huì)影響下游實(shí)驗(yàn)。如果需要獲得更高的質(zhì)粒濃度和*去除乙醇?xì)埩?，可以選擇使用下面的方法。
另一種結(jié)合柱洗脫質(zhì)粒DNA的方法
1. 把結(jié)合柱套在一個(gè)新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)，加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結(jié)合柱的膜上，室溫放置2min，以zui高轉(zhuǎn)速離心(不超過6,000xg)5min以洗脫質(zhì)粒DNA。將洗脫液或去離子水預(yù)熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會(huì)顯著提升zui終的得率。
2. 將洗脫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的適用于沉淀的離心管中。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室溫放置的異丙醇。渦旋以充分混勻，然后以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心30min。小心地去除上清。
3. 用2ml 70%的乙醇洗滌沉淀一次，以不低于15,000×g轉(zhuǎn)速4℃離心10min，小心地去除上清。空氣干燥沉淀5-10min。
4. 加入200-500ul(依據(jù)要求的質(zhì)粒終濃度)Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去離子水重懸DNA。
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