一、準備工作
準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要,工作量也較大,應給予足夠的重視,準備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行.準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,生化培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調試,具體內容可參閱有關文獻.
二、取材
在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經(jīng)過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養(yǎng)皿中,這一過程稱為取材.如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程.機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng).
理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養(yǎng),實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng),分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng),腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng).取材后應立即處理,盡快培養(yǎng),因故不能馬上培養(yǎng)時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養(yǎng)液中保存.取組織時應嚴格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質.取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理.
由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻.
三、培養(yǎng)
將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng).如系組織塊培養(yǎng),則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養(yǎng)基.如系細胞培養(yǎng),一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù),按要求以一定的量(以每毫升細胞數(shù)表示)接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基.細胞進入培養(yǎng)器皿后,立即放入生化培養(yǎng)箱中,使細胞盡早進入生長狀態(tài).
正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態(tài)是否正常,有無污染,培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查.
一般原代培養(yǎng)進入培養(yǎng)后有一段潛伏期(數(shù)小時到數(shù)十天不等),在潛伏期細胞一般不分裂,但可貼壁和游走.過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期.細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng),將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng).每傳代一次稱為“一代”.二倍體細胞一般只能傳幾十代,而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去.轉化細胞可能具有惡性性質,也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性.
培養(yǎng)正在生長中的細胞是進行各種生物醫(yī)學實驗的良好材料.
四、凍存及復蘇
為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存.凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基,以一定的冷卻速度凍存,終保存于液氮中.在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的.
復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解.然后將細胞轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng).
凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響.
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