一、實驗原理
超氧化物皮化酶(superoxide dismutase， SOD) 在生物體內(nèi)廣泛分布， 能伴化超氧陰離子自由基(O2-.)發(fā)生歧化反應(yīng)，從而清除氧自由基，越到防御氧毒、抗輻射+抗衰老等作用·
目前因SOD來源不同測活方法非常多， 但是所測酹活結(jié)果相差較大丶活性單位也不統(tǒng)一。因此， 本方法是針對植物型SOD對腎上腺素自氧化法的各種影響因素進行了研究， 建立一種微量、快速、穩(wěn)定重復性好且適用于植物來源的SOD測定方法·
因植物來源的SOD成分比較復雜， 且有微量的多耐擾氧化物成分。腎上腺素是多耐衍生物， 在堿性條件下會自動氧化， 其中涉及到(O 2-.) 的碰式反應(yīng)， 可被SOD抑制， 腎上腺素經(jīng)多步轉(zhuǎn)化為腎上腺素紅·上腺素紅有480nm和320nm兩個吸收峰-325nm處的吸收更能靈敏地反映自氧化程度·當pH z 10.2， 線性范圍縮短， pH值越高線性范圍越??；pH<10.2時吸光度值極小，易帶入誤差pH10.2維持著良好的線性段，而且斜率適中，可作為實際應(yīng)用中的適pH·溫度在30℃左右，線性關(guān)系較好·著腎上腺素濃度的增加，自氧化速率增大， 線性范圍增加， 當腎上腺素液度為0.4mmol/L使每1min自氧化速率達0.070.提高了靈敏度、減少了誤差。
二、實驗材料及用具
1、實驗試劑
植物SOD樣品(申葉松香草提取) lg pH 7.5質(zhì)量液度0.05mol/L的磷酸鈉綴沖液、兩雨*0.4mmol/L腎上腺素溶液+50mmol/LpH為10.2的Na2CO 3-NaHC 03緩沖液內(nèi)含1*10-4M乙二胺四乙酸二鈉雙蒸水+100mmol/L鹽酸液， 內(nèi)含1*10-4M乙二胺四乙酸二鈉
2丶實驗器具
試管30m、紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋、PHS·3C精密pH計
三、實驗步驟
1配置溶液：配置pH 7.5質(zhì)量濃度0.05mol/L的磷酸鈉緩沖液·50mmol/LpH為10.2的Na2CO 3-NaHCO 3緩沖液及0.4mmol/L腎上腺素溶液(62：38) ；
2植物SOD樣液的制備·將植物SOD樣品， 加入pH 7.5質(zhì)量濃度0.05mol/L的磷酸鈉緩沖液， 于4℃條件下3500轉(zhuǎn)/min離心15min， 取酵液， 加入-20℃預冷兩酮， 取沉淀物落于少量重蒸水中， pH 7.5、質(zhì)量淬度25mmol/L的磷酸鈉透析即得酵的粗提液。
3、將配置好的50mmol/LpH為10.2的Na2CO 3-NaHC 03緩沖液放到30℃±0.5℃的恒溫水溶鍋中保溫20min；
5將配置好的溶液分別放到325nm的分光光度計下測其吸光值， 每隔lm in記一次
吸光值，連續(xù)讀取14分鐘；(試驗中保持溶液溫度在30oC)
6、繪制時間一OD曲線圖，并分析結(jié)果
四、活性測定
腎上晾素法的活力單位定義：30℃時， lml反應(yīng)液中每分鐘抑制腎上腺素自氧化速率達50%時的酶量為一個活力單位。
酵活性計算公式：
U/mg=(0.070-AA325)x100%xV總/[0.070×50%·V。-VS]
其中：
AA325：反應(yīng)吸光值變化值；
V總：反應(yīng)總體積(mL)；
VS：加入樣品液的體積；
Va：活力單位定義體積(lmL)
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