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　　一、試驗(yàn)?zāi)康摹?br /> 

　　1、掌握無(wú)菌操作技術(shù)。
 

　　2、掌握原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng)。
 

　　3、掌握細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇技術(shù)。
 

　　4、了解培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的形態(tài)。
 

　　二、試驗(yàn)原理。
 

　　將動(dòng)物機(jī)體的組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱原代培養(yǎng)。
 

　　細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
 

　　對(duì)具有移動(dòng)特性的穩(wěn)定細(xì)胞系或細(xì)胞株進(jìn)行長(zhǎng)期保存，一方面可以作為細(xì)胞研究的試驗(yàn)材料，另一方面可以做細(xì)胞制品的生產(chǎn)材料。目前廣泛應(yīng)用的細(xì)胞保存方法是低溫冷凍保存法，。細(xì)胞的冷凍保存的原則是慢凍快融，這樣做是為了防止細(xì)胞由于冷凍過(guò)程中產(chǎn)生了冰晶而發(fā)生細(xì)胞破裂。
 

　　三、實(shí)驗(yàn)器材及藥品。
 

　　器材：懷孕的小白鼠、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液器、眼科剪、鑷子、酒精燈、離心機(jī)、水浴鍋、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心管、高壓滅菌鍋、試管架等。
 

　　藥品：小牛血清、DMEM合成培養(yǎng)基、抗生素、DMSO冷凍劑、胰酶、PBS緩
 

　　沖液等。
 

　　四、實(shí)驗(yàn)操作。
 

　　1、消毒滅菌。
 

　　將實(shí)驗(yàn)所需用到的工具(如槍頭、培養(yǎng)皿、眼科剪、鑷子以及每個(gè)人的實(shí)驗(yàn)服等)集中滅菌、烘干。配制75%的酒精以備實(shí)驗(yàn)時(shí)所需。
 

　　2、培養(yǎng)基的配制。
 

　　分別取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培養(yǎng)基，將兩種培養(yǎng)基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混勻就得到了細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液。 3、原代培養(yǎng)。
 

　　(1)、準(zhǔn)備。將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)用到的工具以及藥品全部放在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行紫外消毒滅菌。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前帶好乳膠手套，用酒精對(duì)手進(jìn)行消毒。將懷孕的小白鼠放在酒精中殺死，取出子宮內(nèi)的胚胎組織。
 

　　(2)、剪切與消化。將胚胎組織放于平板中，用眼科剪將組織塊剪碎，剪得越碎越好。將剪碎的組織塊放于離心管中，加入大約200µl的胰酶進(jìn)行消化。也可將其置于37度恒溫箱中進(jìn)行消化。
 

　　(3)、分離細(xì)胞。消化到一定時(shí)間時(shí)，如果離心管中的溶液中出現(xiàn)了明顯的渾濁，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，則應(yīng)該加入與胰酶等量的培養(yǎng)液終止消化。離心管于離心機(jī)中離心，棄上清液，得到分散的細(xì)胞。
 

　　(4)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞并培養(yǎng)。向含有分散細(xì)胞的離心管中加入配制好的培養(yǎng)液，吹打混勻，將培養(yǎng)液用移液器移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置于36.5℃恒溫CO2箱培養(yǎng)，瓶口少少擰的松一點(diǎn)。 4、傳代培養(yǎng)。
 

　　(1)、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)及密度，根據(jù)細(xì)胞密度決定傳代的稀釋倍數(shù)。
 

　　(2)、收集原代培養(yǎng)的細(xì)胞。吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并用PBS沖洗兩遍。然后向培養(yǎng)瓶中加入200µl的胰酶進(jìn)行消化。消化一段時(shí)間后用配置好的培養(yǎng)液等比例終止消化。然后離心，收集到原代培養(yǎng)的細(xì)胞。
 

　　(3)、傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。向離心管內(nèi)加入大約7—8ml的培養(yǎng)液，吹打混勻。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，置于37度恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)1—2天后于顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。
 

　　5、細(xì)胞冷凍保存。
 

　　(1)、收集細(xì)胞。吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并用PBS沖洗兩遍。然后向培養(yǎng)瓶中加入200µl的胰酶進(jìn)行消化。消化一段時(shí)間后用配置好的培養(yǎng)液等比例終止消化。然后離心，收集細(xì)胞。
 

　　(2)、冷凍。向離心管中加入一定量的培養(yǎng)液以及10%—20%的DMSO冷凍液，吹打混勻并轉(zhuǎn)移到冷凍管中。先將冷凍管在4度冰箱中放置10min，再放在—70度的冰箱中冷凍過(guò)夜。
 

　　(3)、復(fù)蘇。將冷凍的細(xì)胞取出來(lái)后，立刻放在40度水浴中，使其快速融化。并對(duì)融化的細(xì)胞 進(jìn)行進(jìn)一步的觀察。
 

　　五、實(shí)驗(yàn)分析與討論。
 

　　從本次實(shí)驗(yàn)的圖片可以看出來(lái)，實(shí)驗(yàn)做得還算成功，細(xì)胞基本上沒(méi)有被污染。在做的過(guò)程中一定要非常注意無(wú)菌操作，這是決定試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。在做原代培養(yǎng)的時(shí)候，一定要將小鼠胚胎的組織塊剪得夠碎，確保在用胰酶消化后可以得到分離的單個(gè)細(xì)胞。在做傳代培養(yǎng)時(shí)，要把握好胰酶的消化時(shí)間。冷凍復(fù)蘇時(shí)，一定要按照步驟進(jìn)行冷凍，遵循慢凍速溶的原則。