用了許多方法檢測小鼠的肝臟、腦部、睪丸等組織的細(xì)胞凋亡，其中 TUNEL 法做的多，我購買的試劑盒主要是 roche、 promega 公司，結(jié)果大多數(shù)成功，偶爾也有失敗，下面我把實驗中的關(guān)鍵問題與大家共享一下，同時也希望能對初學(xué)者有所幫忙。


       TUNEL法的實驗原理

       基本原理：對不同組織切片先增加細(xì)胞膜通透性，然后讓 rTDT 和生物標(biāo)記的 dTUTP 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在 rTDT 的輔助下 dTUTP 與核斷裂的 DNA 3’-OH 結(jié)合，再用 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素與 dTUTP 上的 biotin 結(jié)合（每個鏈霉親和素至少可以再結(jié)合 3 個 biotin 分子），后用 DAB、過氧化氫與 SP 上的辣根過氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應(yīng)，形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色，終通過計數(shù)每張切片上不同視野中 TUNEL 陽性細(xì)胞的比例來判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。（小編碎碎念：掌握原理是做好實驗的先決條件，不少人還以為是抗體抗原反應(yīng)呢）

       TUNEL實驗中關(guān)鍵步驟

1.充分脫蠟和水化

脫蠟可以先 60ºC 20 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻；

2.把握好細(xì)胞通透的時間

一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時間；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達(dá)到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。

3.適當(dāng)延長 TUNEL 反應(yīng)液的時間

一般是37ºC 1 h，你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至 2 h，但要結(jié)合你終的背景著色。

4.DAB 顯色條件的選擇

一般 DAB 反應(yīng)10 min 左右，結(jié)合鏡下控制背景顏色，長不超過 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃紅色），不利于辨認(rèn)棕褐色，我不太喜歡。

5.PBS 的充分清洗

在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格，可增加次數(shù)達(dá) 5 次，因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著色。

6.內(nèi)源性 POD 的封閉

對于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，我的經(jīng)驗是適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達(dá)到很好的封閉效果，且不影響終的特異性染色。

       細(xì)胞通透的時間選擇

       1.蛋白酶 k 的目的是通透細(xì)胞膜和核膜，從而使反應(yīng)試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高陽性率。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片，只要不脫片，好像影響不大，其作用類似與 TritonX100 等細(xì)胞通透劑。

       2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份，用完一支再用下一支，-20ºC保存 1 個月應(yīng)該沒問題的（重復(fù)拿的那支），而一直冷凍的至少可以用半年以上。

       3. 蛋白酶K反應(yīng)時間一般為10-30 min，具體時間長短與切片厚薄有關(guān)，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，終通過摸索jia時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。

       關(guān)鍵試劑操作條件

       DAB 顯色反應(yīng)大約需要10 min，要控制好反應(yīng)時間，勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度、試劑盒種類不同來摸索一下。

蛋白酶K工作液處理時間、溫度須在范圍內(nèi)摸索，溫度過高，時間過長，易破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。

       DNase 1 一般室溫，10 min 即可。

       如何減弱非特異性染色

       若是肝臟或腎臟，因富含內(nèi)源性過氧化物酶，需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間。其他還可以加強(qiáng)滅活、縮短 DAB 孵育時間、PBS 充分清洗，注意鏡下把握好著色。

       其他注意事項

       1.濕盒用帶蓋方盤，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片，使用時稍加水即可。

       2.英文說明書中對組織細(xì)胞通透這一步中，加了“對難處理的組織的處理”，意思是用常規(guī)方法處理（如蛋白酶 K)后，應(yīng)該陽性而做不出陽性時，可用微波修復(fù)。

       3.復(fù)染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，以利于結(jié)果分析，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色。

       4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制，現(xiàn)在有賣的，自己加蒸餾水稀釋后即可用，很方便，也不貴。蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封閉液。

       5. 未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上直至使用。

       6. 結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA斷，從而引起假陽性結(jié)果；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果

       7.棕色是陽性細(xì)胞沒錯；棕色+藍(lán)色的細(xì)胞核為藍(lán)黑色，趨黑色，所以是可以判斷的。如果結(jié)果片子全是藍(lán)色的，那就是說沒有陽性細(xì)胞核。實驗失敗。陽性細(xì)胞核可以被染上，只不過是藍(lán)黑色而已。注意分辨。Tunel后鏡檢一下看看陽性細(xì)胞核在什么位置；然后再輕度復(fù)染即可。注意比較分辨哪些是陽性細(xì)胞。