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做實驗 | 用釣魚的心態(tài),做熒光原位雜交實驗

時間:2018-11-5閱讀:378
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 熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH),縮寫為FISH,就是魚的意思,以此類推,做熒光原位雜交也叫釣魚。

熒光原位雜交實驗 它的實驗原理也挺像釣魚的:它是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針,按照堿基互補的原則,與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合,形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列,因而探針可以直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。你們看,像不像在茫茫大海里面釣魚呢?探針像不像魚鉤呢?

 

釣魚實驗的特點:操作煩瑣,步驟簡單。

說它操作煩瑣,是因為它的操作步驟巨多,每一步又需要相當(dāng)長的時間,如果自己標(biāo)探針的話每批標(biāo)本大約三天時間(買試劑盒只需一天,但價格昂貴),你說是不是很煩瑣?說它步驟簡單則是因為FISH只要操作過程仔細(xì),嚴(yán)格按照操作步驟操作,很容易做成功,比PCR要簡單得多。將繁瑣的簡單步驟做好也是有門道的。

探針設(shè)計,量身定制 探針就是魚鉤。魚鉤不管用,還能釣得上大魚嗎?設(shè)計探針要根據(jù)實驗的需要來進(jìn)行,也就是說你要檢測的目的基因決定你的探針設(shè)計。這就像是一個老練的漁夫會根據(jù)不同的魚的種類來選擇魚鉤一樣。舉個例子,如果目的基因大概是1.8KB,可以直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行*標(biāo)記。也可以找技術(shù)服務(wù)公司幫你設(shè)計合成探針,每條探針設(shè)計合成大概3500。

 

組織切片和載玻片的選擇

組織切片4~5μm 厚,過厚或過薄的切片均會對信號的強弱產(chǎn)生影響,而且切片應(yīng)完整,質(zhì)量良好,否則會在預(yù)處理時掉片。載玻片的選擇建議使用防脫載玻片,有條件的實驗室可使用更好的陽離子或者陰離子載玻片,可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。


注意標(biāo)本預(yù)處理細(xì)節(jié)

標(biāo)本的處理也是關(guān)系到后信號強弱的關(guān)鍵,但有些人不注意這些細(xì)節(jié),結(jié)果造成熒光信號弱,難以分辨。這與預(yù)處理不當(dāng)造成探針難以達(dá)到飽和而雜交難以進(jìn)行有關(guān)。


變性要規(guī)范

這一步是FISH關(guān)鍵中的關(guān)鍵。變性包括標(biāo)本變性和探針變性,這兩個步驟關(guān)系到FISH的成敗,千萬要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行,不但如此,特殊標(biāo)本還要自己摸條件。試想變性不*,DNA的雙鏈都沒能*打開,雜交能順利進(jìn)行嗎?


操作熒光抗體時要避光

操作熒光抗體的時候千萬要避光,否則將前功盡棄啊。舉個例子吧。魚竿,魚鉤,魚餌都備齊了,也不能保證一定就能釣到大魚兒。魚兒上鉤了之后,還有一個把魚拖上岸的終過程。在FISH,就是使用熒光顯微鏡觀察和記錄結(jié)果。在正常情況下,目前商業(yè)化的探針即使是雜交以后,熒光信號能保存半年之久。有時候,信號也會急劇衰減,幾分鐘后就不見了。就像魚兒一開始上鉤了,馬上又掙脫魚鉤,重返大海了。出現(xiàn)這種情況,就是由于沒有嚴(yán)格避光。因此在觀察和記錄的時候,要盡可能地在暗室里面操作。這和以前洗照片是一個原理哈。

當(dāng)然,也有偷懶的招術(shù)。那就是:抗熒光淬滅劑(antifade),在封片觀察的時候加入,可以延緩熒光的淬滅。注意:如果一次沒有成功,可以將探針洗掉,再進(jìn)行雜交。這又像極了釣魚。第yi次魚兒脫鉤了,我們可以換個魚鉤再釣,直到釣到大魚為止。

 

FISH其實做出來還是很漂亮很漂亮的。讓我們一起感受一下生物學(xué)的大美。

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