*,Western blot(WB)和免疫組化(IHC)都屬于免疫學常用的實驗技術。WB是通過SDS-PAGE分離蛋白質樣品,然后轉移到固相載體上,利用抗原與抗體特異性結合的原理進行樣品檢測,可用于定性和半定量。而IHC是融合了免疫學原理(抗原抗體特異性結合)和組織學技術(組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等),通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色,對組織(細胞)內抗原進行定位、定性及通過Image J進行定量的研究(主要是定位)。與WB相比,IHC實驗步驟復雜,涉及的試劑和物品種類繁多,所以IHC的垃圾分類更要認真對待。那么,IHC實驗中的垃圾到底有哪些?又該如何分類呢?古朵小編從IHC的實驗步驟開始和大家逐一敘述。
IHC(石蠟切片)都有哪些步驟
一、 石蠟組織切片制作
固定:使組織樣本盡量保持其離體前狀態(tài),多采用4%多聚甲醛固定液。
脫水:水和透明劑不能互溶,只有脫去水分后,才能讓透明劑進入。使用梯度乙醇進行脫水。75%、85%、95%、*、*乙醇,每步1h-2h左右。
透明:乙醇不能與石蠟相溶,還需用能與乙醇和石蠟相溶的媒浸液,替換出組織內的乙醇。二甲苯是常用的透明劑,可以很好地與石蠟互溶。將組織依次放入二甲苯與無水乙醇的等體積混合液、純二甲苯和純二甲苯中進行透明。
浸蠟與包埋:用石蠟取代透明劑,使石蠟浸入組織而起支持作用,便于在切片機上夾持切片。用于包埋石蠟的熔點在50~60℃之間。
切片:將包埋組織的蠟塊固定在切片機上,切片厚度一般為4~8μM。
貼片:把切片放入50℃水中,攤平后用多聚賴氨酸處理過的載玻片撈起,室溫晾干。
二、 脫蠟復水
干燥后的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液中進行染色。如果不經過復水,直接進入染色劑中,材料將會嚴重變形,甚至難以染色。
先烤片,將切片放于60℃烘箱中烘烤。
二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10~15min。
放入*、*、95%、85%、75%等梯度乙醇溶液中各3min。
放入蒸餾水洗兩次×5min。PBS(或PBST)洗三次×3 min。
三、 抗原修復
甲醛的固定使細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇,同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。在染色前需進行抗原修復或暴露。
將切片浸入0.01M檸檬酸鹽緩沖液中,再放入微波爐中加熱10 min,之后冷卻切片?;蛘?,用EDTA-*消化液37℃消化10 min。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。用吸水紙將切片組織周圍擦干。
四、 滅活內源性過氧化氫酶
去除組織中的內源性酶催化底物,避免染色的非特異性。
用免疫組化筆圈出樣品,滴加3%*孵育10min。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。
五、 封閉
為減少背景產生的非特異性染色,使用非免疫動物血清進行封閉。
滴加動物血清封閉液,室溫封閉30min。
甩去多余液體,用吸水紙將切片組織周圍擦干。
六、 抗體結合
滴加一抗,4℃孵育過夜。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。
滴加辣根酶標記的二抗,37℃孵育30min。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。
七、 底物顯色
DAB顯色5-10min,在顯微鏡下掌握染色程度,然后PBS或自來水沖洗1min。
八、 復染
襯托出組織細胞的形態(tài)結構,更好地對目標蛋白進行定位。
蘇木素復染1-3min。
PBS或自來水沖洗1min。
九、 分化
1%的鹽酸酒精分化2~3秒,PBS或自來水沖洗兩次×5min。
十、 脫水和透明
75%,85%,95%,*,*的乙醇浸泡各2min。
二甲苯浸泡兩次×2min。
十一、 封片
用蓋玻片和中性樹膠進行封片。之后鏡檢。
IHC(冰凍切片)實驗怎么做
一、冰凍
將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(直徑約2cm),如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內,當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰,此時小盒保持原位切勿浸入液氮中,大約10-20s組織即迅速冰結成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆茫蛑萌牒憷湎淝衅瑱C冰凍切片。
注意:針對儲存在-80℃溫度下的組織,切片前,從冷凍柜中取出組織樣品,在-20℃的溫度下均衡約15分鐘。這樣可以防止切片在封閉時破裂。
二、切片
用OCT包埋劑浸沒組織。將組織切成厚度在6-8μm之間的切片,置于多聚賴氨酸粘附的載玻片上。固定前,將切片放置在工作臺上風干幾分鐘(這樣可以增加切片的粘附作用)。
三、固定
選擇適宜的固定劑,可采用丙酮固定,-20℃下冷凍10分鐘,風干。
之后,同上面實驗步驟:滅活內源性過氧化氫酶→封閉→抗體結合→底物顯色→復染→分化→脫水透明→封片→鏡檢。