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一、核酸的純化
在分子克隆的所有操作中,zui基本的操作是核酸的純化。其關(guān)鍵步驟是去蛋白質(zhì),通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每當(dāng)需要把克隆有某一些所用的酶滅活或去除以便進(jìn)行下一步時(shí),可進(jìn)行這種抽提。然而,如要從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化核酸,則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后,再用有機(jī)溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括*及蛋白酶K等,它們對(duì)多種天然蛋白均有活性,(1)用酚氯仿抽提:這兩種有機(jī)溶劑合用,比單獨(dú)用酚抽提的除蛋白效果geng佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸樣品置有蓋小離心管中,加入等體積的酚/氯仿。②旋渦混勻管內(nèi)容物,使呈乳狀。③12000×g室溫離心15秒。④水相移入另一離心管,棄去兩相界面和有機(jī)相。⑤重復(fù)步驟①-④步操作,直至兩相界面上見(jiàn)不到蛋白質(zhì)為止⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。
二、核酸的濃縮
應(yīng)用zui廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價(jià)陽(yáng)離子存在下,加入一定量的乙醇后,所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收,甚至對(duì)低至pg量的DNA或RNA,也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度,再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。
具體操作時(shí),可向含樣品的小離心管中加入V/10單價(jià)陽(yáng)離子鹽貯存液2V無(wú)水乙醇,混勻,放冰水浴中15-30min,取出目測(cè)平衡,0-4度,12000g,離心10min。吸棄上清,再另70%乙醇0.5-1ml,12000g,0-4度洗滌離心2min。吸棄上清,沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后,溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。
單價(jià)陽(yáng)離子鹽溶液
| 貯存液(mol/L) | 終濃度(mol/L) |
(醋酸銨* | 7.5 | 2.0-2.5 |
LiCl | 8.0 | 0.8 |
NaCl | 2.0 | 0.2 |
醋酸鈉 | 3.0(pH5.2) | 0.3 |
*:當(dāng)加醋酸銨時(shí),需加入DNA液的V/2。
單價(jià)陽(yáng)離子鹽的選擇,主要基于下述考慮:用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀,但在以后要作核酸的磷酸化時(shí)應(yīng)避免用醋酸銨,因銨離子是T,多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時(shí),常用LiCl,因LiCl在乙醇中溶解度很高,不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品,應(yīng)使用NaCl,這時(shí)該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀,大多使用醋酸鈉(pH5.2 )。
三、DNA、RNA的定量
準(zhǔn)確的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸樣品是純凈的(即無(wú)顯著的蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品)。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm兩個(gè)波長(zhǎng)處的光吸收,然后,按IA260相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。40μg/ml單鏈DNA或RNA及20μg/ml單鏈寡核苷酸。計(jì)算你的樣品含量。260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值(A260/A280),可反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染,則A260/A280將明顯低于此值,此時(shí)就無(wú)法對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行精que定量??蓪悠芳兓笤僮鞫繙y(cè)定。有豐富實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的人,僅憑樣品電泳后溴化乙錠染色螢光帶的強(qiáng)度,即可大致判斷出樣品中的核酸含量,故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。
四、核酸的凝膠電泳和分子量參照物
(一)瓊脂糖凝膠電泳
可用于分離、鑒定和提純DNA片段。本法操作簡(jiǎn)單、迅速,能分辨其它方法不能分開的DNA片段混合物,分開的DNA可用低濃度的螢光染料(0.5μg/ml溴化乙錠)染色,在紫外燈下直接觀察檢測(cè)少至1ng的DNA。
DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數(shù):①DNA分子的大?。壕€獎(jiǎng)雙鏈DNA分子通過(guò)凝膠的速率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比。據(jù)此用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)分子量的DNA片段同時(shí)電泳,比較其電泳速率,即可求出待測(cè)片段的分子大小。②瓊脂糖濃度:給定大小的DNA片段,以不同速度通過(guò)不同濃度的瓊脂擴(kuò)凝膠。因此利用不同濃度的凝膠,可分辨范圍廣泛,大小不同的DNA片段
不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍
濃度<%(w/v) | 分離線狀DNA分子的有關(guān)范圍(Kb) |
0.3 | 5-60 |
0.6 | 1-20 |
0.7 | 0.8-10 |
0.9 | 0.5-7 |
1.2 | 0.4-6 |
1.5 | 0.2-3 |
2.0 | 0.1-2 |
③DNA構(gòu)型:相同分子量的閉環(huán)(Ⅰ型),開環(huán)(Ⅱ型)和線狀(Ⅲ型)DNA,以不同速率通過(guò)凝膠,一般情況下,遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④應(yīng)用的電壓:在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但是壓增高時(shí),大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的,因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的大分辨力,凝膠電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)5V/cm。
(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳
可用于分析和制備小于1Kb長(zhǎng)度的DNA片段
DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍
丙烯酰胺濃度<%(w/v)> | 有效分離范圍(bp) |
3.5 | 100-1000 |
5.0 | 80-500 |
8.0 | 60-400 |
12.0 | 40-200 |
20.0 | 10-100 |
聚丙烯胺凝膠多用垂直平板電泳,準(zhǔn)備凝膠時(shí),先配制30%單體母液(29克丙烯酰胺,1克雙丙烯酰胺,加水溶解,定容至100ml),再用它來(lái)配制所需濃度的凝膠。每100ml上述液體加30μl四甲基乙胺(TEMED),混勻后即可灌注于予先準(zhǔn)備好的潔凈不滲漏的凝膠玻板,待凝膠灌至近頂端時(shí),立即插入合適的“梳子”,放室溫聚合60分鐘,若冬天室溫太低,則可放37度溫溫箱內(nèi),以促進(jìn)聚合。聚合完成后,拔出“梳子”,將凝膠板固定于電泳槽中,向電泳槽傾入1×TBE,用滴管沖洗加樣孔和凝膠底部以除去氣泡,即可加樣電泳。一般所用電壓1-8v/cm,隨時(shí)觀察標(biāo)記染米的遷移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中,標(biāo)記染料遷移速率與下述DNA片段的速率相同
標(biāo)記染料在PAG中的遷移*
凝膠濃度(%) | 溴酚藍(lán) | 二甲苯腈藍(lán) |
3.5 | 100 | 460 |
5.0 | 65 | 260 |
8.0 | 45 | 160 |
12.0 | 20 | 70 |
20.0 | 12 | 45 |
*這些數(shù)字是與染料共同遷移的DNA片段的近似大?。ㄒ詁p計(jì))。電泳結(jié)束,從電槽中取出玻板并小心地撬開,凝膠浸于溴化乙錠液(0.5μg/ml1×TBE)染色,45min后放紫外燈下觀察電泳結(jié)果。
(三)分子量參照物
為了判斷目的DNA片段的大小,常在同一凝膠的目的DNA旁加一分子量參照物,同時(shí)電泳并染色后,就能在紫外燈下很快知道目的片段的大小。zui常用的分子量參照物是 Hind Ⅲ消化物,各片段的大小以bp表示,分別為:23130,9416,6557,4361,2322,2027,564,125。
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