自噬是近年來很熱門的領域,很多人傻傻分不清自噬和死亡。
自噬的過程——從一張圖開始
步驟 1:細胞接受自噬誘導信號后,在胞漿的某處形成一個小的類似「脂質(zhì)體」樣的膜結(jié)構,然后不斷擴張,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一個由 2 層脂雙層組成的碗,可在電鏡下觀察到,被稱為 Phagophore,是自噬發(fā)生的鐵證之一。
步驟 2: Phagophore 不斷延伸,將胞漿中的任何成分,包括細胞器,全部攬入「碗」中,然后「收口」,成為密閉的球狀的「自噬體」,即 autophagosome。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有 2 個特征:一是雙層膜,二是內(nèi)含胞漿成分,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等。
步驟 3:自噬體形成后,可與細胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合(加了個「可」字,意思是這種情況不是必然要發(fā)生的)。
步驟 4:自噬體與溶酶體融合形成 autolysosome,期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解,二者的內(nèi)容物合為一體,自噬體中的「貨物」也被降解,產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞漿中,供細胞重新利用,而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞漿中。
自噬的研究方法
正常培養(yǎng)的細胞自噬活性很低,不適于觀察,因此,必須對自噬進行人工干預和調(diào)節(jié),經(jīng)報道的工具藥有:
1. 自噬誘導劑
Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激
Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化鋰):IMPase 抑制劑(即 Inositol monophosphatase,肌醇單磷酸酶)
Earle's *:制造饑餓
N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway 抑制劑
Rapamycin:mTOR 抑制劑
Xestospongin B/C:IP3R 阻滯劑
2. 自噬抑制劑
3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K)hVps34 抑制劑
Bafilomycin A1:質(zhì)子泵抑制劑
Hydroxychloroquine(*):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶體腔堿化劑)
除了選用上述工具藥外,一般還需結(jié)合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預:包括反義 RNA 干擾技術(Knockdown)、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/p>
自噬的觀察與檢測
細胞經(jīng)誘導或抑制后,需對自噬過程進行觀察和檢測,常用的策略和技術有:
1. 觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結(jié)構,普通光鏡下看不到,因此,直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore 的特征為:新月狀或杯狀,雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。
自噬體(AV1)的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構,內(nèi)含胞漿成分,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。
自噬溶酶體(AV2)的特征為:單層膜,胞漿成分已降解。(autophagic vacuole,AV)
2. 在熒光顯微鏡下采用 GFP-LC3 融合蛋白來示蹤自噬形成
由于電鏡耗時長,不利于監(jiān)測(Monitoring)自噬形成,人們利用 LC3 在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術。無自噬時,GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中;自噬形成時,GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,一個斑點相當于一個自噬體,可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。
3. 利用 Western Blot 檢測 LC3-II/I 比值的變化以評價自噬形成
自噬形成時,胞漿型 LC3(即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w)膜型(即 LC3-II),因此,LC3-II/I 比值的大小可估計自噬水平的高低。
LC3 抗體對 LC3-II 有更高的親和力,會造成假陽性。方法 2 和 3 需結(jié)合使用,同時需考慮溶酶體活性的影響。
4. MDC 染色
MDC 染色即 Monodansylcadaverine,單丹磺酰尸胺染色,包括自噬體,所有酸性液泡都被染色,故屬于非特異性的。
5. CellTrackerTM Green 染色
主要用于雙染色,但其能染所有的液泡,故也屬于非特異性的。
自噬相關蛋白定位
在研究自噬相關蛋白時,需對其進行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關系密切,為了區(qū)別,常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位:
Lamp-2:溶酶體膜蛋白,可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合。
LysoTrackerTM 探針:有紅或藍色可選,顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito:載體,轉(zhuǎn)染后表達一個融合蛋白(紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號),可用來檢測線粒體被自噬掉的程度(Mitophagy)。
MitoTraker 探針:特異性顯示活的線粒體,熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60:定位與線粒體基質(zhì),細胞死亡時不會被釋放。
Calreticulin(鈣網(wǎng)織蛋白):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。
Note:這些蛋白均為胞漿蛋白,爬片或*消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜(permeablize),可采用 0.1% SDS 處理。
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